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【求助】提取细菌RNA有DNA污染怎么办

发布于 2015-12-23 · 浏览 2423 · IP 北京北京
这个帖子发布于 9 年零 132 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近一直提取细菌RNA,想做qRT-PCR,是新手,多次用promega试剂盒进行提取RNA,每次都有DNA污染,求助啊~~
1.用未逆转录的RNA进行电泳,有些样品23S上方还是依稀看到有条带的。(时间紧急忘记加marker)
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2.用未逆转录的RNA进行PCR,结果都有阳性条带;
3.用未逆转录的RNA进行qPCR, 取RNA 0.5ul上样,体系20ul,结果CT 都是15-30之间。本以为是痕量DNA不会太大影响结果,看到CT值,感觉DNA污染太严重了,让我更加不敢用了。
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我看到很多帖子有下面2种方法解决:
1.设计引物跨越内含子设计,但是原核生物基因组DNA也没有内含子,就无法通过设计引物来避免基因组DNA影响qPCR结果;
2.将提取的RNA最后再用DNA酶处理,然后用EDTA灭活DNA酶,或者是酚氯仿抽提,但是大多会说最后逆转录都没有条带出来了,或者RNA得率很低。
我尝试用promega提取RNA试剂盒重新将提取的RNA再次进行DNA酶处理,以及后面的RNA洗液步骤,最后出来的结果是:
再次提取的RNA电泳看不到任何条带;
再次提取的RNA直接进行pcr有阳性条带;
同时将再次提取的RNA、以及逆转录后的cDNA分别进行qPCR 两者CT值很贴近,都是20-25范围内。
看到这样的结果我泪奔了······
毕业将近,时间紧迫,问题困扰了好久不知如何解决,求助园子里高手,有没有好的办法提取原核生物的RNA。小女子在这里谢过了~~













最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 2423

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