mRNA生产：（2）DNA模板生产

这一步是使用PCR为后续体外转录（in vitro transcription，IVT）准备充足的DNA模板。PCR使用的前引物中掺入了T7启动子和修饰过的二核苷酸（AG）转录起始位点，用于共转录5‘加帽。但是也可以选择其他启动子如SP6或T3。后引物与末端3‘UTR序列结合，包含了在扩增过程中掺入3‘端的长多聚胸苷束（poly(T) tract）。

递减/降落PCR（touchdown PCR）可优先用于单个特定产物的扩增，但也适用于大多数DNA模板。然而，如果出现非特异性产物，可以优化PCR反应或者通过凝胶纯化来提取正确大小的DNA模板。由于小于500nt的DNA模板可能难以特异性扩增，我们建议使用不掺入多聚胸苷束的后引物。在这种情况下，poly(A)尾需要通过酶促多聚腺苷酸化反应来添加。

poly(A)尾对于mRNA稳定性起着重要作用，应该在PCR扩增过程中精确掺入。去除和截短poly(A)尾都会导致翻译和表达的减少。poly(A)尾的长度可以使用毛细管凝胶电泳来确定，也可以使用下一代测序（next-generation sequencing，NGS）进行更详细的分析。

PCR可以准确地生产高质量的DNA模板，但是也可以在低亚克隆频率（<2%）下产生错误和突变，特别是扩增重复序列或者困难序列。因此，我们建议每批PCR均使用新合成的DNA模板，而不是回收之前的扩增子，以减少PCR错误的堆积。

PCR扩增的DNA模板可以用紫外分光光度仪（UV spectrophotometer），如Implen、QuBit或NanoDrop检测浓度，260/230和260/280吸光度值来确定产量和纯度。如果没有得到足够高的DNA浓度，后续进行体外转录（IVT）反应时可能需要用更大的体积。但是如果DNA浓度低于100ng/ul，我们建议使用真空离心或者减少洗脱体积来重复柱纯化而进行浓缩。

分析扩增的DNA模板纯度和大小通常使用Tapestation和D5000 ScreenTape。如果无法使用这些仪器，也可以用琼脂糖凝胶电泳。这种情况下，我们建议在非变形的1-2%琼脂糖凝胶上跑5ul PCR产物。高质量的模板将显示为单个清晰条带，而质量较差的模板将出现多个条带、模糊或者拖尾。

对于一些比较难的mRNA设计，PCR可能无法生产DNA模板。比如，即使尽量尝试解决了很多问题，很长的（>10kb）或重复的模板仍然可能无法生产特异性的DNA模板。在这些情况下，线性化质粒可能是更好的更适合的DNA模板。对线性化质粒更详细的讨论可以在Recombinant and In Vitro RNA Synthesis : Methods and Protocols这本书的第43-58页或这篇文章https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/cpz1.39 中找到。