利用CRISPR-Cas9进行靶基因敲除编辑（第一讲）：gRNA 设计

1.基本原理

CRISPR-Cas9 是一种细菌获得性免疫，用于降解入侵的外源 DNA。CRISPR RNA (crRNA) 与转录激活 crRNA (Trans-activating crRNA， tracrRNA)退火形成的复合物能特异性识别与其互补的基因组序列，引导 Cas9 核酸内切酶在目的片段生成 DNA 双链断裂。

（图1 CRISPR-Cas9系统示意图）

当DNA形成双链断裂切口后，即可触发体内细胞主要的双链DNA断裂修复机制，主要是非同源重组末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HR）两条途径。

（图2 CRISPR-Cas9系统诱发的双链DNA断裂触发的修复机制示意图）

2.gRNA设计

gRNA负责引导Cas9蛋白到靶基因编辑点，进行互补配对后，对DNA靶位点进行精准的切割。

（图3 gRNA设计原理示意图）

以TP53为例进行sgRNA设计：

（1）进入CHOPCHOP网站，链接为：http://chopchop.cbu.uib.no/；输入框输入“TP53”，点击“Find Target sites”

（2）根据排序及效率选择至少2条sgRNA：

（3）对约20nt的sgRNA进行添加酶切位点，比如以排序第一的序列，点击进去，可以看到该sgRNA的详细信息，包括脱靶效率等信息评价。

复制序列信息：CGCTATCTGAGCAGCGCTCATGG

注意分析该序列，已经包含PAM序列（红色标记），CGCTATCTGAGCAGCGCTCATGG，因此，真正的sgRNA序列为CGCTATCTGAGCAGCGCTCA（蓝色标记）。

（4）对sgRNA序列添加BsmbI酶切位点(小写)

➊  5‘—caccgCGCTATCTGAGCAGCGCTCA –3’

（5）写出与sgRNA序列互补配对序列

➋  5‘—TGAGCGCTGCTCAGATAGCG—3’

（6）对sgRNA互补配对序列添加酶切位点（小写）

➌  5‘—aaacTGAGCGCTGCTCAGATAGCGc—3’

（7）利用Snapgene对➊和➌进行退火确认sgRNA oligo互补配对及酶切位点

（8）➊和➌即是所需的设计好的sgRNA oligo，就可以发给公司合成。

这样，针对TP53敲除的sgRNA就设计完成了。

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