关于western blotting的几个笨笨的问题？

几个问题都是入门级的，请大家包涵。
1.我要做的两个蛋白大小分别是30kda和70kda，用的胶浓度分别为15％和 8％，为了省事儿，我可以分别配制不同的胶，然后在同一个电泳槽同一时间电泳吗？

2.做完SDS-PAGE后，对转膜前的胶是不是没有必要进行考马斯亮蓝染色的，这个染色是不可逆的，以至于染色之后被染的蛋白颜色是一直去不掉，这就干预了以后的western印迹。但是分子克隆却说转膜前对胶进行考马斯染色可以提供一个内部标记，这些应该怎么理解啊？

3.如果用actin做western内参的话，我是不是只用买actin的一抗就可以了？然后在用一抗孵育的时候，actin一抗和目的蛋白一抗是同时稀释在同一份抗体稀释液里面吗？具体的操作步骤应该怎样？

4.做western一定要用内参吗？我的总蛋白已经定量了，上样量一致，还有必要用内参吗？

5.western 的阴性对照和阳性对照是怎么设定的？

6.在用半干转膜的时候，我设定了电流50mA，电压25v，但是为何在转膜过程中，电压显示才1v呢？是不是转膜缓冲液有问题，或是滤纸和膜剪裁得不好？还是其他的问题？

谢谢大家。