分子克隆（质粒构建）基础三：载体与目的片段的重组

1重组

指的是将目的片段与载体进行连接，常规的方法就是使用酶切手段，选择相同的限制性内切酶（或产生互补粘性末端的酶），分别切割载体和目的片段，使两者产生可互补配对的末端。再通过DNA连接酶或者噬菌体整合酶等将两者连接。

2限制性内切酶

是一类能识别并切割双链 DNA 分子中特定核苷酸序列的酶部分限制性内切酶举例：

①BamH1:切割后暴露出5’端GATC四个碱基

②KpnI:切割后暴露出3’端GGTAC五个碱基

③EcoRV:切割后产生平末端

④DpnI:特异性识别并切割甲基化或羟甲基化的双链 DNA 序列 “Gm6ATC”

3限制性内切酶反应体系

以赛默飞的限制性内切酶为例，分为快切酶和慢切酶：

慢切酶：不同的酶有不同的buffer

快切酶：快切酶公用一套buffer

酶切结束后需要进行跑胶验证，正确的话进行胶回收并且测浓度

酶切产物跑胶验证的操作步骤

1. 样品准备

取酶切反应液（通常 5-10 μL），加入上样缓冲液Loading Buffe，混匀。

准备对照样品（关键！用于对比）：

未酶切的原始载体：判断载体是否被切开。

DNA 分子量标准（Marker）：用于估算片段大小（如 10kb DNA Ladder）。

2.琼脂糖凝胶制备

◦根据载体大小选择凝胶浓度：载体分子量较大（如 5-10 kb）时用 0.8%-1% 琼脂糖凝胶；较小（如 2-5 kb）时用 1%-1.2%，确保酶切前后的片段能清晰分离。

3. 电泳操作：将样品依次加入凝胶孔中，注意避免样品溢出。以 100-120 V 电压电泳 30-40 分钟。

4. 结果观察:电泳结束后，将凝胶置于紫外透射仪下观察，记录条带位置和亮度。

判断：

单酶切：出现单一线性化条带（与未酶切载体的超螺旋 / 开环条带位置不同）。

双酶切：出现两条带，大小之和等于原始载体长度（与 Marker 比对一致，有的时候由于两个酶切位点相邻得比较近，较小得带在胶上未显示，但是位置不同了也可以判断）。

对照对比：酶切产物条带与未酶切载体有明显差异，无未切开的载体残留（或极少）。

4重组的方法有哪些

①普通粘性末端连接：用限制性内切酶切割目的基因和质粒，产生粘性末端，再通过 DNA 连接酶连接，形成重组质粒，实现目的基因的克隆与载体构建 。

②TA克隆：TA 克隆是一种快速克隆 PCR 产物的方法，大部分耐热性DNA聚合酶Taq DNA聚合酶进行PCR反应时都会在PCR产物的3′末端添加一个“A”，T载体是3′带有一个“T”的载体，在连接酶作用下（），完成连接，其连接液可以直接用于细菌转化（TA克隆一般用于鉴定，不用于准确的克隆，因为这个过程中使用的酶是Taq酶，前面我们提到这个酶的错配率较高）

③金门克隆：Golden Gate 克隆技术依赖于1996年首次发现的IIS型限制酶（如BbsI和BspQI,BbsI 识别序列为GAAGAC，如下图所示，在识别位点外进行切割，产生4个碱基的粘性末端），利用这一特性，在目的基因切割位点外设计IIS型限制酶（BsaI或BbsI）识别位点，酶切连接后该识别位点被消除，不会出现在最后的载体中；载体上含有与目的基因的切割位点互补的突出末端，可以指导连接。

④Gateway克隆：Gateway 克隆技术是基于 λ 噬菌体的位点特异性重组系统（att 位点重组）建立的克隆方法，其原理是利用重组酶（如 Int、IHF、Xis）介导目的基因两端的 attB 位点与载体上的 attP 位点发生特异性重组，将目的基因克隆到入门载体（产生 attL 位点）；随后，无需限制性内切酶和连接酶，通过目的基因两端的 attL 位点与目的载体上的 attR 位点在重组酶作用下再次重组，即可将目的基因转移到不同的目的载体中，实现目的基因在多种载体间的高效、定向、无缝转移。

λ 噬菌体（Lambda phage）与大肠杆菌（E. coli）基因组基于 att 位点的重组过程：attP（λ 噬菌体上的附着位点 ）、attB（大肠杆菌基因组上的附着位点 ）、attL 和 attR（重组后产生的新附着位点。

首先需要通过PCR反应获得含有attB片段的目的基因，并且准备含有attP片段的供体载体，通过重组反应后，目的基因就转移到了供体载体上，生成入门克隆，这一反应就是BP反应；之后通过LR反应，入门克隆与含 attR 位点的目的载体，在 LR 克隆酶作用下，再次经位点特异性重组，把基因转移到目的载体，得到表达克隆，并产生含 attP 位点和 ccdB 基因的毒性副产物。

⑤同源重组：首先需要在DNA片段的末端加上同源片段，然后将这些DNA片段和一种mix混合孵育后转化感受态细胞。这种mix含有三种不同类型的酶

1)T5外切酶，从5’端开始对DNA进行消化，从而产生黏性末端，便于与另外的同源末端进行配对结合。

2)DNA聚合酶，用于修补产生的gap。

3)DNA连接酶，实现无痕拼接，形成完整的DNA分子