【求助】我的原核表达究竟哪里出了问题？急！谢谢。

　　我现在做原核表达但是一直出不来很奇怪，我首先ＴＡ连接到Ｔ载体，然后酶切回收片断后连到pET20b中，转ＴＧ１，抽出后转ＤＥ３，但是就是最后没有蛋白出来，我每步抽提质粒以后都酶切和ＰＣＲ鉴定都是有插入片断的，就是最后没有蛋白出来，非常急人，而且我也换了ＰＱＥ３１载体，同样是每步抽提的质粒鉴定都是有片断的，但是最后转到Ｍ１５中就没有蛋白出来，非常奇怪。（而且我表达了两个蛋白都是这种情况，所以估计是系统的问题）
　我现在考虑，是不是由于我的引物前面有ＢａｍＨＩ的位点，同样Ｔ载体上也有这个酶切位点，会不会因为在Ｔ载体上酶切不完全，回收的片断带入了Ｔ载体上的十几个ｂｐ，导致阅读框改变产生中止密码子，我一般是酶切３７度两个小时，用的是Ｓｉｂｅｎｙｍｅ的内切酶，不知道会不会因为这个原因产生问题，或者还有什么情况会产生这种问题，请大家指教一二，万分感谢。