【实验技术】载体构建的方法介绍

在探索基因功能的实验中，基因克隆是一种基本的操作方法。我们需要过表达目的基因以判断其发挥的功能，因此我们需要将目的基因构建到表达载体上，再将载体转染至宿主。

●通过双酶切来构建载体是其中常用的一种方法，双酶切实验利用限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸的原理，用两种不同的限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有粘性末端的靶基因片段，与同样经两种限制性内切酶切割得到的带有相同粘性末端的线性载体在T4DNA连接酶作用下进行连接，从而完成载体构建。

●如果遇到酶切效率及连接效率不高等问题时，可以采用同源重组的基因克隆方法，相比双酶切载体构建方法，该方法的构建过程有些不同。一是载体切割过程中只需要进行单酶切；第二载体和目的基因片段的连接是基于同源重组而不是粘性末端互补。

双酶切构建载体方法

 1.载体制备

选择单一酶切位点，或含有多克隆位点(MCS)。

2.插入片段制备

克隆的插入片段来源可能为基因组DNA、另一质粒的一部分或者线性DNA片段。无论来源DNA类型如何，制备插入片段时常用的第一个步骤是进行限制性酶切，产生匹配的粘性末端，以便接下来将片段插入在载体中。

常用双酶切体系如下：  

组分

体积

载体

2μg

buffer

5μL

酶1

1.5μL

酶2

1.5μL

ddH2O

补足20μL

total

20μL

37℃，酶切1-2h

具体反应温度及反应时间可以根据实际情况调整

3.连接

T4 DNA ligase连接。

连接体系如下：

组分

体积

载体

1.5μL

目的片段

3.5μL

T4 DNA ligase Mix

5μL

16℃，30 min

根据DNA片段类型和所需的得率，反应温度范围可能为14°C至25°C，反应时间可能为10分钟至16小时（过夜）。通常，反应温度越高，所需的时间越短，但得率也越低（具体反应温度及反应时间请参考T4连接酶的产品说明书）

4.转化

连接成功的载体，通过转化的方式来筛重组子。转化的具体方法可以参考：【实验技术】质粒的转化和扩增-热激法

5.克隆筛选

为了更方便地筛选出含有连接成功重组载体的细菌，一般会采用“蓝/白”筛选法及阳性筛选法。

双酶切质粒示意图

双酶切法常见问题：

1.总是切不开怎么办？

答：换一种加热方式，不同实验室情况不同，可能是选用的加热方式不稳定导致。或者考虑换酶、调整酶切体系等。

2.连不上怎么办？  

酶切产物与载体的比例需要掌握好，一般情况下，酶切产物：载体摩尔比=3：1~9：1；双酶切时一定不要选择产生同样黏性末端的不同酶，同尾酶会造成片段插入载体的方向不固定，插入方向错误会导致无法正常表达翻译；

3.酶活性的影响因素有哪些？

DNA的纯度、DNA的甲基化程度、DNA的分子结构、缓冲环境（缓冲液的pH及离子强度）和反应温度。在实验时要考虑这些因素，以提高反应的成功率。

同源重组法构建载体

 1.制备载体

需将线性化载体制备好，既可以选择酶切，也可以选择PCR的方式制备线性化载体。

2.扩增目的片段

通过PCR的方法，设计引物使目的片段的两端加上了与载体末端相应的同源序列。

3.重组反应

按比例混合线性化载体和目的片段，50℃反应20 min。

4.转化，鉴定

同双酶切法，将重组产物直接转化后涂平板，挑取克隆进行阳性鉴定。

同源重组法常见问题：          

 1.胶回收的产物低，浓度不足以做连接时，可以增加实验的起始量，因为大部分胶回收试剂盒的回收率仅为30%~60%，所以载体酶切和扩增片段时可以用200μl的跑胶体积。  

2.扩增的PCR产物无条带或者条带弱时，需要检查引物的Tm值以及GC比，可以更换引物或者改变PCR的条件，使其达到最优。

3.涂板后没有菌落或很少菌落时，可能是线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足或过量，或者比例不佳，也可能使用单酶切载体后，载体自连所致，建议使用双酶切法切割载体，防止自连。

4.构建质粒时，目的基因的片段不要大于载体的长度，如果基因片段为载体长度的 1/2 以上，会加大连接的难度。