研究细胞选择性自噬起始的方法——文献解读

俗话说得好“抛开时空谈分子机制是不现实的”，就像古希腊大哲人赫拉克利特说“人不能两次踏进同一条河流”一样，生命体中的所有物质都是流动的，所以在进行科学研究的时候也不能忽略这一点。

今天就给大家带来一篇研究细胞选择性自噬起始到结束过程中时空有序性调节的文章。该文发表于Molecular Cell，2019年IF：15.5。

老规矩，思路图奉上

当我们开篇就看到这张思路图时不禁会疑惑： 这文章不是研究自噬的吗？ 图里怎么没有自噬小体的经典结构出现呢？

我们来看Highlights：

Highlights：

1.NDP52/TBK1以ULK1为靶标，在没有LC3的情况下启动自噬。

2.自噬受体TBK1的磷酸化促进NDP52通过FIP200与Atg13/ULK1复合体结合。

3.ULK1在底物上被激活，与AMPK和mTOR活动无关。

4.异位募集FIP200结合肽足以对底物进行自噬性降解。

原来如此，本文发现了一个不依赖于LC3的自噬启动途径，而且大部分探讨的是自噬这整个过程的起始阶段，即如何精准靶向需要被降解的细胞器（本文是线粒体），促使线粒体上选择性自噬体的形成。

Background：

都知道自噬对于细胞内各种成分的大量降解和细胞内稳态至关重要。但少有研究阐明自噬小体可以围绕特定的亚细胞结构（如线粒体等细胞器）进行选择性降解，即选择性自噬。

虽然涉及许多ATG蛋白的自噬小体形成的精心安排的步骤已经被阐明，然而目前还没有明确的机制阐明是如何将底物识别与自噬的生物发生联系起来，也不确定是什么提供了靶向指示效应来使早期的自噬小体在细胞器附近形成从而让这些细胞器被指定为即将被自噬性降解的。

已知ULK1复合体是自噬小体生物发生过程中最上游的机制，由ULK1激酶、FIP200、ATG13和ATG101组成。但目前尚不清楚ULK1在选择性自噬过程中是如何被激活的。本文所要探讨的，就是选择性自噬形成的早期阶段。

Results：

Fig1:化学诱导蛋白定位法研究NDP52介导的有丝分裂吞噬作用

作者为了分离NDP52在自噬小体生物发生中的作用，用了一种在不干扰细胞代谢的情况下，通过诱导FKBP和FRB二聚化的化合物，将NDP52定位到线粒体上的化学诱导法(图1A)，可以通过成像(图1B)和流式分析(图1C)检测到线粒体出现线粒体溶酶体。

在去极化诱导的线粒体自噬过程中，NDP52（一种自噬受体）和其他一些自噬相关蛋白被招募到线粒体。将NDP52定位于PINK1KO（PINK1knock out）细胞中的线粒体发现，在线粒体形成方面与KO组WT细胞没有差异(图1D)。因此，NDP52 的异位募集可以独立于PINK1/Parkin通路诱导线粒体自噬。NDP52的线粒体定位可招募ATG蛋白：FIP200、ATG14和ATG16L1(图1E-1J)。ATG14和ATG16L1位于FIP200下游，参与自噬小体的成熟。这些结果表明，NDP52的靶向引导足以动员ATG蛋白启动选择性自噬。

总的来说，fig.1论证了：

NDP52可以靶向底物复合物启动ATG，当定位于线粒体时，NDP52可以直接启动线粒体自噬并招募各种ATG蛋白，这表明NDP52可能与线粒体自噬的生物发生相互作用。

Fig2: NDP52通过FIP200与ULK1复合物相互作用

接着，作者就继续探讨并揭示了内源性NDP52会与内源性ULK1复合物：ULK1激酶、ATG13和FIP200结合（图2A、B）。

此外，NDP52与ULK1复合物的结合在Parkin介导的线粒体自噬，NDP52与ULK1复合物的结合具有一定的特异性（图C），因为在FIP200 KO（FIP200 knock out）细胞中，NDP52不再与ULK1结合，表明NDP52需通过FIP200与ULK1复合物结合(图2D)。

Fig3: NDP52-FIP200相互作用的功能分析

为了证实NDP52和FIP200的相互作用，作者进行了突变定位验证（图3 A）。NDP52（SKICH结构域）的缺失抑制了NDP52与FIP200的结合(图3B)，比较FIP200截断突变体发现，只有FIP200的C-末端与NDP52有亲和力（图3C-D）。因此，NDP52的SKICH结构域与FIP200结合似乎对NDP52底物定位诱导的线粒体自噬具有重要意义。含有FIP200的C-末端亮氨酸拉链结构域的肽也足以沉淀NDP52（E-H）。

Fig4：NDP52介导不依赖LC3的自噬小体发生

目前流行的选择性自噬模型认为，自噬受体如NDP52，会通过泛素结合域将泛素化产物与预先形成的自噬体连接起来，通过其LC3相互作用区域扩大脂化LC3的自噬体。

但是作者却发现，在LC3/GABARAP蛋白缺失的情况下，自噬体仍然可以选择性地在底物周围形成（B），相反地，作者同时也发现LC3/GABARAP蛋白在自噬体-溶酶体融合步骤中十分重要（D-I）。因此，作者推测自噬受体是直接在底物上启动分离膜形成的第一步中发挥了作用，那自噬受体如NDP52、OPTN和Tax1bp1就很可能是底物识别和自噬小体生物发生时空启动之间的缺失环节（J）。

以上，作者通过图4验证了LC3/GABARAP蛋白不是自噬体靶向的必要条件，而是在自噬小体-溶酶体融合中所必需的。此外，这些结果同样表明 NDP52与LC3蛋白的结合的自噬机制并不是通过与ULK1复合后，选择性降解泛素化底物的自噬模型。

在此基础上作者想到如果NDP52将ULK1复合物定位到特定的底物上可以启动自噬小体的从头开始生物发生，那么其他能够结合FIP200的蛋白当人工靶向线粒体时也可能诱导有线粒体自噬。在补充图中作者使用合成的FIP200结合肽的实验证实，将ULK1复合物定位到底物上会启动选择性自噬。

Fig 5：ULK1在底物上的异位定位驱动选择性自噬的发生，而不依赖于能量感知途径。

图2中作者验证了NDP52需通过FIP200与ULK1复合物结合(图2D)。但目前还不清楚ULK1在选择性自噬过程中是如何被激活的。那它是如何被激活的呢？作者研究了两个自噬经典通路。

此前有报道称，ULK1是在线粒体自噬过程中被AMPK激活的。作者通过AMPKα1/2双KO细胞分析发现，这些细胞在PINK1/Parkin介导的线粒体自噬中没有缺陷(5A-5B)。此外，通过实验证实了ULK1/2激酶活性是PINK1/Parkin介导的线粒体自噬所必需的(图5A-5D)。 而在没有AMPK的情况下，ULK1对底物细胞器的定位也足以启动选择性自噬。

前期研究发现当细胞内能量丰富时，mTOR磷酸化ULK1 S757位点，可以抑制其自噬功能。因此，作者测试了mTOR磷酸化ULK1如何影响其与底物结合时启动自噬的能力。结果表明，在营养补充状态下，靶向ULK1在底物上随后诱导选择性自噬，可以绕过mTOR对自噬的抑制。

这些结果表明ULK1在底物上被激活，与AMPK和mTOR活动无关。

Fig 6：TBK1通过促进NDP52-ULK1复合物结合正向调节线粒体自噬

前面的研究表明NDP52诱导线粒体自噬的能力取决于它与FIP200/ ULK1复合物的相互作用。TBK1是磷酸化选择性自噬受体，功能是增加泛素结合和滞留在底物上。

在TBK1 KO细胞中将NDP52定位线粒体上，使诱导的自噬作用减弱，但在自噬受体KO细胞中没有减弱，进一步表明TBK1除了有稳定底物上的受体外还具有稳定受体的功能(图6A)。另一方面，揭示了TBK1可以促进NDP52与ULK1复合物的结合(图6C)。

作者发现线粒体定位的TBK1在ULK1/2抑制剂存在的情况下不能诱导线粒体自噬，这表明TBK1定位在底物会导致ULK1的上游激活(图6I-K)。

以上证明，TBK1通过促进NDP52-FIP200/ULK1复合物的结合，调节NDP52在底物上招募和激活ULK1的能力(图6L)。

Fig7：嵌合FBD-Parkin可以补偿线粒体自噬过程中TBK1或受体蛋白的丢失

线粒体损伤会导致PINK1/Parkin激活，导致线粒体外膜蛋白泛素化。

作者使用的化学诱导二聚分析法并不会激活PINK1/Parkin通路，从而绕过了底物泛素化。缺乏TBK1或自噬受体蛋白的细胞在处理6小时后出现线粒体自噬缺陷(图6F)。FBD-Parkin在这两种KO细胞中的稳定表达可以挽救线粒体自噬缺陷，绕过NDP52/TBK1在去极化诱导线粒体自噬过程中招募ULK1复合体的功能(图7B)。

作为对照，作者将一个不能与FIP200(E230R/E241R)结合的FBD突变体与Parkin融合。由于功能上的Parkin，这种嵌合体在WT细胞中启动了线粒体自噬，但不能挽救TBK1或受体KO细胞中的线粒体自噬缺陷(图7C)。将FBD与线粒体易位缺陷的Parkin突变体融合也无法挽救WT和KO细胞的线粒体自噬(图7D)。

这些数据进一步表明，TBK1和NDP52的一个关键功能是将ULK1复合物靶向泛素化的底物。

那今天的分享就到这里啦~