棕榈酸溶液诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗模型

—陈志超《石参提取物改善胰岛素抵抗的HepG2细胞糖代谢的作用及其机制研究》

0. 引言

2017年出版的《糖尿病防治指南》指出，我国是全球第一大糖尿病患病国，除了大量确诊的患者以外，还有约4千万处于糖尿病前期的患者。而糖尿病前期主要是由于机体出现胰岛素抵抗(IR)而引发。已有的大量研究表明，血中游离脂肪酸(FFA)的升高是诱导机体各种效应器官产生胰岛素抵抗的常见原因。因此，通过药物的干预，对抗游离脂肪酸诱导的胰岛素抵抗状态，可作为防治2型糖尿病发生发展的有效手段。石参Uraria crinita L．，豆科狸尾豆属植物猫尾草的干燥根，为广东省梅州市特产之一，已有的研究表明其对链脲霉素诱导的糖尿病小鼠有降糖降脂的作用，而体外研究表明其有一定的抗氧化应激保护胰岛细胞的作用。本研究拟采用高脂诱导人肝癌细胞株HepG2，复制肝细胞IR模型，以探讨石参提取物对胰岛素抵抗状态下肝细胞糖代谢的改善作用。

1.材料

6 mmol/L即用型棕榈酸液体溶剂(西安鲲创科技发展有限公司，批号:KC003)。

利用商品化的细胞用高脂毒性试剂，母液含有６mM棕榈酸，由于试剂本身为液态，能与基础培养基直接互溶用于实验，减少了旧方案使用BSA、乙醇等助溶剂和溶解时的加热操作，节省了操作，增强了实验的稳定性。

2.方法

2.1 CCK－8法检测棕榈酸和药物对细胞的毒性

HepG2细胞以1×10³/孔接种于96孔板中，12h后，换入0，50，100，200，300，400μmol/L的棕榈酸溶液或0，10，20，50，100，200μg/mL的石参水提物、石参总黄酮及石参总皂苷，每组6个复孔。培养24h后，每孔更换为完全培养基配置的CCK8溶液，培养箱中继续孵育30min，用酶标仪在450nm处检测各孔吸光度。（CCK8孵育时间一般建议1-2h，本研究在30min可以观察到CCK8溶液显色改变，此时检测吸光度也合适）

2.2培养基上清葡萄糖含量检测

HepG2细胞以5×10⁴/孔接种于24孔板，12h后，换入含棕榈酸溶液或含棕榈酸及药物的培养基对细胞进行干预，培养24h后，收取细胞上清液，利用葡萄糖检测试剂盒检测其中的葡萄糖含量;收取上清后换入含10^－7M胰岛素的完全培养基继续培养24h，然后以同法检测其中的葡萄糖含量。

2.3实时荧光定量PCR

HepG2细胞以1×10⁵/孔接种于6孔板，12h后，换入含棕榈酸及药物的培养基干预24h，按照Trizol试剂盒的步骤收集细胞提取总RNA;提取总RNA并定量后，参考cDNA试剂盒的步骤进行逆转录，最后参考qPCR试剂盒步骤进行RT－PCR，对各给药组的GLUT－2、PDK－1、PEPCK－1以及PGC－1α的转录量进行检测。

2.4蛋白免疫印迹

HepG2细胞以1×10⁵/孔接种于6孔板，12h 后，换入含棕榈酸及药物的培养基干预24h。利用WesternBlot 法检测HepG2细胞内IRS－1、Akt、p－Akt、FoxO1、p－FoxO1等蛋白的变化。将HepG2细胞用含酶抑制剂的裂解液进行裂解后收集总蛋白，BCA法检测蛋白浓度并调整各组蛋白到2mg/mL，按每泳道10μl进行上样;蛋白电泳采用10%的SDS－PAGE凝胶，完成电泳后进行湿法转膜，然后用2%BSA溶液封闭1h，最后在 4℃下孵育一抗过夜。完成一抗孵育后，用1X PBST洗膜，然后在室温下孵育二抗1h，完成后再次用1X PBST洗膜，最后利用ECL发光液和凝胶成像系统对蛋白条带进行显影并收集图像，各蛋白的相对表达量通过待测蛋白/内参蛋白的比值进行表示。(此处蛋白上样量每孔20ug，这个量是可以调整的。如果，某个目的蛋白丰度低或抗体不太好用，可以通过提高蛋白上样量的方式进行优化。)

2.5统计学方法

采用SPSS 25软件进行统计学分析，采用 GraphPad软件进行图表制作，各组间利用one－ANOVA法进行差异分析，以P＜0．05作为统计学上有显著差异。

3结果

3.1棕榈酸对HepG2细胞的细胞活力及葡萄糖利用的影响

如图1所示，当棕榈酸的浓度在200μmol/L以内时，棕榈酸对HepG2细胞无显著毒性(P＞0．05)，且由于IR模型主要为非损伤性模型，因此，后续的模型构建棕榈酸的浓度以200μmol/L为界值。

又如图2所示，随着棕榈酸的浓度的升高，诱导后的细胞上清所剩余的葡萄糖含量逐渐增加，同样的趋势也出现在用胰岛素刺激细胞后的细胞上清中。培养时间一致时，随着棕榈酸的浓度升高，两次上清葡萄糖含量的差别越来越少，这也说明了，随着棕榈酸浓度的升高，肝细胞胰岛素抵抗水平越来越高。

综合上述结果，200μM的棕榈酸浓度为构建HepG2细胞IR模型的最适浓度。

通过上述实验证明了棕榈酸能有效的诱导出肝细胞糖代谢异常，而根据油红染色图及阳性面积半定量分析可以知道，随着棕榈酸浓度的升高，细胞内脂质沉积的现象愈加明显，说明肝细胞脂质代谢紊乱的情况随棕榈酸浓度升高而增大。

综上所述，在非损伤的浓度范围内，随着棕榈酸浓度的升高，肝细胞糖脂代谢异常状态愈加显著，因此，根据本部分实验数据，后续实验选择以200μM的棕榈酸浓度作为诱导浓度以建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型。

4讨论

细胞内胰岛素信号缺陷是导致胰岛素抵抗的核心原因，而根据近年的一些针对非糖尿病患者开展的流行病学研究表明，机体外周血中游离脂肪酸的含量升高将显著增强机体对胰岛素的抵抗性，长期以往，过高的游离脂肪酸将逐渐抑制细胞糖代谢相关的信号通路，并介导正常机体转变为糖尿病前期甚至是2型糖尿病。而在细胞糖代谢相关的信号通路中，PI3K/Akt通路为最经典及核心的通路，已有的大量研究表明，过高的脂肪酸可显著抑制PI3K/Akt通路，进而诱发细胞胰岛素抵抗状态。

本研究通过利用常见的长链饱和脂肪酸－棕榈酸，构建了稳定的体外肝细胞胰岛素抵抗模型，并以此探讨了石参这一两广地区常见的药膳材料的水提物、总黄酮及总皂苷对模型的逆转作用。结果显示，石参各提取物皆能有效的改善IR的HepG2细胞对葡萄糖的利用能力，其机制可能与其能增强细胞糖酵解的同时抑制糖异生相关，而这些作用可能与其能上调PI3K/Akt通路的活性有关，且在受试的三种提取物中，石参总黄酮对棕榈酸诱导的胰岛素抵抗的改善作用最佳。

小编有话说：本篇研究的作者详细讲述了棕榈酸（PA，KC003）建立诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗模型的步骤及相关检测指标，给诱导2型糖尿病细胞模型的实验者们，提供了很好的参考。

参考文献

陈志超，周珏宇．石参提取物改善胰岛素抵抗的HepG2细胞糖代谢的作用及其机制研究[J].时珍国医国药，2019,39（10）