[专题]【翻译】使用增强谐波灰阶超声检查评价射频消融术后小的肝细胞肝癌

使用增强谐波灰阶超声检查评价射频消融术后小的肝细胞肝癌
－超声与组织病理的相关性


目的 为了评价利用宽频增强谐波获得射频消融诱导的凝固性坏死灰阶超声图像有效性，我们比较了消融肿瘤的组织和病理特性与肿瘤的超声图像之间的关系。方法 48个病人共72个肝细胞肝癌接受了经皮射频消融治疗，肿瘤最大直径不超过3cm。有4个病人共6个肿瘤消融后1个月又接受了手术切除。其余66个肿瘤消融后1个月通过18号细针穿刺活检进行评价。用组织病理学方法检查切除的肿瘤＆活检的标本，结果与增强谐波宽频灰阶超声检查所获得的结果进行对比。苏木伊红染色的标本不能够决定细胞是否有生命力；因此需要通过组织化学（乳酸脱氢酶和二磷酸吡啶核苷酸、磷酸硫辛酸脱氢酶）染色来决定细胞是否有生命力。结果 72个肿瘤中5个(6.9%)射频消融后的增强谐波宽频灰阶超声检查显示残余肿瘤增强，这5个肿瘤组织病理结果是肿瘤残余。其余67个肿瘤 (93.1%)在超声检查上无残余肿瘤增强；然而，在组织病理检查时只有66个肿瘤没有显示肿瘤残余。增强谐波宽频灰阶超声图像提供的结果与组织病理学的结果这一诊断标准相当；超声图像探察残余肿瘤组织的敏感性、特异性分别为83.3% (5 of 6) 、100% (66 of 66)。结论 增强谐波宽频灰阶超声检查是评价肝细胞肝癌射频消融治疗效果的一种有价值的技术。
关键词 增强超声 肝细胞肝癌 病理发现 射频消融

作为一种治疗局灶性恶性肝脏肿瘤的侵袭性最小的技术，射频消融术经皮诱导的凝固性坏死最近得到了广泛的关注。这种技术的价值包括治疗不能进行外科手术的病人；和外科手术相比降低了并发症发生率；能够使用实时的引导技术。最近，一些研究者报道射频消融术治疗直径小于3cm的肝细胞肝癌的完全坏死率达到80％－98％。，然而直径3－5cm的大肿瘤完全消融率仅65％。为了提高射频消融治疗的肝细胞肝癌病人的生存率，残余肿瘤的检出、额外的治疗例如二次射频消融以及酒精注射治疗是很重要的。
射频消融治疗的效果可以通过增强CT、增强MRI和能量多普勒超声来评价。增强CT是临床随访最主要的方法，然而，在射频消融后的CT图像上常常可以看到在消融区域附近消融周边良性增强。这种发现在增强的MRI上也能够发现，因此被认为是代表对热损伤细胞的炎性反应。然而，当周边呈不规则增强时，鉴别炎症与肿瘤残余很困难。能量多普勒超声已经作为一种有效的、非侵袭性的方法来评价肝细胞肝癌的血流，据报道增强的能量多普勒超声在探察射频消融后残余肿瘤很敏感。然而，能量多普勒超声易受组织运动伪影干扰。因此，对呼吸不能很好控制的病人和肝细胞肝癌的位置接近心脏、大血管的病人这种方法的使用受限。
谐波宽频（脉冲反转）灰阶超声检查是一种有希望的新技术，它对微泡的探察的，敏感性很高；这种技术最近被用于肝脏。Meloni等报道增强的脉冲反转谐波超声检查探察残余伪消融肿瘤比常规增强能量多普勒超声更敏感。；然而就我们所知，目前针对肝细胞肝癌病人还没有正式的研究，来研究射频消融引导的凝固性坏死的超声结果和组织病理结果的关系。
本研究使用一种新颖的增强超声技术来评价已经接受射频消融治疗的肝细胞肝癌病人的残余肿瘤存在的情况。然后超声检查的结果与手术切除和活检的标本组织病理结果对比。本方法使用增强谐波宽频灰阶超声检查来评价射频消融后残余肝细胞肝癌，局部肿瘤残余的可能性也被评价。我们假定该技术可以被用于评价消融治疗后是否需要额外治疗，因此该技术提高了临床成果。
材料和方法
病人

2000年1月－2002年3月，116位病人因X线诊断为肝细胞肝癌而入我院。该研究的纳入标准如下：(1)有一个或多个治疗（最多3个）；(2) 最大肿瘤直径不超过3cm； (4) 没有门静脉癌栓，肝外转移或腹水。68个病人被排除该研究，48个病人共72个肝细胞肝癌被纳入研究，直径0.7－3.0cm(mean ± SD, 2.1 ± 0.7 cm) 。42个病人患肝硬化，6个病人患慢性肝炎；3个病人患乙肝；43个丙肝；2个非乙非丙型肝炎。在研究最初没有机构评审委员会存在，所有本研究在赫尔辛基宣言的指导下进行，获得了所有病人和亲属的知情同意书。
研究的设计
在消融治疗前和治疗后1月均进行增强谐波宽频灰阶超声检查和经皮细针穿刺活检。4个慢性肝炎病人的6个肿瘤在消融后1个月又接受了手术切除。切除的标本进行大体和组织病理检查，发现与增强谐波宽频灰阶超声检查的结果对比。而且，治疗后1月增强超声评价没有血管的肿瘤再接受增强CT随访15个月。
射频消融技术
所有肿瘤技术射频消融治疗。使用了由肌肉内注射喷他左新＆hydroxyzine chloride（氯化胆碱？）组合的镇痛技术，病人的意识是清醒的。给1％的盐酸利多卡因进行局麻。使用超声引导（CV6000，东芝，***），一个15号的3或3.5cm多频可扩张的电极（LeVeen 针，射频消融治疗公司, Sunnyvale, CA)被插入肿瘤，然后钩子打开。当针的位置在超声上显示后开始消融。为了使电路完整，将一个外置的电极板放在病人的大腿上。射频消融的频率是460KHz，最大输出功率是100W，能量由一个射频消融发生器产生(RF2000，射频消融治疗公司)。
按一下步骤进行2阶段的操作：最初发生器输出量是50W,时间1分钟，接着功率每分钟增加10W直到达到90W。这种输出持续15分钟或者持续到电路阻力超过200欧（也被称为滚边显像），这时开始降低输出功率直到达到基线阻力。60秒后，用以前功率的75％的功率进行第二阶段的治疗，第二阶段的射频消融持续15分钟或者持续到电路阻力超过200欧。每次治疗60秒后在基线水平记录能量、电流、阻力。对每位病人都持续进行血压、呼吸、脉搏、心电监测。射频消融后观察病人72小时，如果没有并发症，可出院。
射频消融前的声像图
射频消融以前，所有48个病人均接受了增强谐波宽频灰阶超声检查。超声检查通过一个配有3.5MHz的凸阵探头的超声诊断仪（西门子，Issaquah, WA)进行。肝脏经过基本的灰阶扫查（发送频率3.4MHz，接受频率3.4MHz），接着由帧频2－5/s的增强谐波宽频灰阶超声检查（发送频率2.5或2.8MHz，接受频率5.0或5.6MHz）。传输的能量是100％，机械指数是1.5－1.9。焦点放在肿瘤的底部。在静脉注射浓度为300mg/ml的半乳糖、棕榈酸混合的造影剂(Levovist, 0.5 mL/s;总量7mL; 先灵, 柏林, 德国)之后，5％的葡萄糖溶液经一个20或22号导管经肘前静脉以5.0mL/min的速度持续注入。病人要求轻轻吸气并闭气30秒（在给造影剂后20－50秒，动脉期）。动脉期以后，通过系统的电影回放功能一副一副的回放存贮在磁光盘上的图像。这一过程大约耗时15－35秒（平均25秒），给造影剂进入肝实质之间的血池留了时间。在给造影剂60－180秒后病人闭气几秒钟的时间再次扫查整个肝脏，检查门脉期强化的结果。如果病人闭气有困难，帧频就变成从2变到5帧/s。我们接着从电影回放模式一副一副的重现这一序列，并将图像存在磁光盘上以便打印。所有病例门脉期至少扫查3分钟。整个检查都记录在SVHS录像磁带上。
我们评价图像在动脉期肿瘤内血管是否存在，和门脉期肿瘤内的多血供增强区。如果在门脉期肿瘤的强化等于或高于周围肝实质的强化，就判定肿瘤为“多血供“；强化的方式又分为均匀强化和不均匀强化。
射频消融后的声像图
再射频消融后1个月，按上述规定进行增强谐波宽频灰阶超声检查。选择一个月的时间间隔是因为作为一种评价射频消融后肿瘤组织生存力的方法，组织学检查有一定的局限。因为射频消融后立即进行检查，消融灶周围存在出血环。我们在声像图动脉期评价肿瘤内血管的存在＆门脉期肿瘤内的多血供区。射频消融后消融灶观察到任何一种发现，就是考虑残余肿瘤增强。
组织病理检查
在超声引导下用一个18号活检针进行经皮多针活检。在活检前进行增强谐波宽频灰阶超声检查。如果增强超声结果显示治疗后肿瘤内存在多血供区，就在多血供区采集2个以上的样本，在非增强区采集2个样本。如果增强超声结果没有显示任何多血供区增强区，就在消融区随机采集4个以上样本。
射频消融后4周的样本在苏木伊红染色时没有显示典型的凝固性坏死，只显示细胞不可逆的损伤，包括细胞质中乳酸脱氢酶的缺失，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的缺失（还原型辅酶Ⅱ），硫辛酸脱氢酶（线粒体酶）功能的缺失，这表示细胞的死亡。使用液氮将样本在Tissue-Tek OCT化合物冷冻。总之，冷冻的样本被包埋在玻璃载片上，并用水冲洗。然后，将样本在室温下和乳酸脱氢酶溶液（乳酸钠112mg，四唑硝基兰2.5mg，二磷酸吡啶核苷酸1.5mg，和10mM的磷酸盐缓冲液5ml；Ph值7.4）或NADPH 黄递酶反应液（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸10mg，四唑硝基兰5mg，10mM的磷酸盐缓冲液10ml；Ph值7.4）反应。然后样本由2位病理学专家检查。
如果在一个以上的活检样本上观察到存活的肿瘤细胞，就认为有残余的存活的肿瘤组织。如果在所有的活检样本上都没有观察到存活的肿瘤细胞，就认为没有存活的肿瘤组织。
以相同的固定、冷冻保存技术来检查射频消融后的样本。切除的肝脏样本被切成0.5cm厚的片，并在保存前用脚规测量新鲜组织凝固性坏死的范围。
图像分析
增强谐波宽频灰阶超声检查和组织病理检查以盲法设计评价。依据4位作者的判断作出评价（2个超声工作者，2个病理学家），这4位专家在不知道组织结果的情况下盲法判断。结果列成表，并比较阳性结果。2个超声工作者对3个肿瘤的分类不同，所有的作者研究就最终结果达成一致。
结果
一般来说，所有病人都能耐受射频消融术。在治疗过程中心脏、呼吸参数保持稳定。两阶段射频消融平均时间是26分钟，从7分钟到30分钟不同。整个经皮操作不超过60分钟。
射频消融前的声像图
射频消融前，所有的结节在增强谐波宽频灰阶超声检查的动脉期或门脉期显示肿瘤强化。72个肝细胞癌中35个(48.6%)在动脉期显示肿瘤内血管的存在，而门脉期72个(100%)肿瘤都显示多血供强化；47个(65.3%)肿瘤呈均匀强化方式，其他25个肿瘤呈不均匀强化方式。
射频消融后的声像图
射频消融后1月，进行增强谐波宽频灰阶超声检查，接受治疗的72个肿瘤中67个(93.1%)表现为没有肿瘤内没有血管信号的低回声区，5个(6.9%)显示肿瘤内有残余增强；有3个肿瘤在动脉期观察到肿瘤内血管，5个肿瘤在门脉期均观察到多血供区(图 1A and 2A)。
组织病理学检查4个病人的6个肿瘤进行了手术切除，其余66个肿瘤进行了活检。在手术切除的标本上，可以很容易的将黄褐色到炭灰色的消融组织和未治疗的组织区分开，消融组织的周围是由正常肝细胞组成的安全区，最外边是一个由纤维组织组成的暗边(图 1B)。肿瘤中观察到的深色组织的中心区被认为是由于凝固的肝细胞肝癌干燥、强烈炭化形成。细胞存活力是由组织化学染色（乳酸脱氢酶＆NADPH 黄递酶）所判定，对包含正常未被加热的肝细胞的组织，细胞的生存力是非常显著的。热凝固区域是没有染色的，表明肿瘤细胞100％的破坏。
射频消融后组织化学染色显示6个手术切除标本中4个(66.7%)没有细胞存活，66个活检标本中62个(93.9%)没有细胞存活，6个显示肿瘤残余。2个有肿瘤残余的手术切除的肿瘤在苏木伊红染色和组织化学染色的切片上，肿瘤边缘显示未治疗的有存活力的部分，凝固性坏死没有超出肿瘤的边缘。(图 2, C–E).

图1. 射频消融后1月，从一个64岁女性身上切除的肝细胞肝癌标本。肿瘤直径24mm。A, 射频消融后的增强谐波宽频灰阶超声门脉期声像图，肿瘤内没有显示多血供的区域。B, 大体的检查显示一个黄褐色到炭灰色的消融组织区。肿瘤内深色的区域是由凝固的肝细胞肝癌干燥、强烈炭化形成。其周围区域代表热凝固正常组织的安全边缘。外周的黑色的窄环表示致密的纤维包膜。箭头表示消融区的周边带。

图2. 射频消融后1月，从一个68岁男性身上切除的肝细胞肝癌标本。肿瘤直径12mm。A, 射频消融后的增强谐波宽频灰阶超声门脉期声像图，肿瘤内显示多血供的区域（箭头的头），箭头显示消融周边区。B, 大体的检查显示肿瘤内一个不规则的黄褐色的消融组织区和未消融区。箭头显示消融周边区。C, 苏木伊红染色. 箭头显示消融周边区（原始放大率 ×40倍）。D, 乳酸脱氢酶染色.在热凝固的肿瘤内可以显示残余有生存力的细胞（箭头的头，蓝色染色）。箭头显示消融周边区（原始放大率 ×40倍）。E, NADPH 黄递酶染色. 在热凝固的肿瘤内可以显示残余有生存力的细胞（箭头的头，蓝色染色）。箭头显示消融周边区（原始放大率 ×40倍）。
超声与组织病理相关性
所有切除的标本和67个活检标本的66个(98.5%)，射频消融1月后，增强谐波宽频灰阶声像图上缺乏灌注的区域与病理学观察到的凝固区相对应。在增强谐波宽频灰阶声像图上看到的消融肿瘤的最大直径比切除后标本组织化学检查时的实际测量结果的差异在2mm之内(表1)。对于射频消融后残余未治疗的肿瘤组织的探察，射频消融术后1月的增强谐波宽频灰阶声像图上显示的残余血管与乳酸脱氢酶染色、NADPH 黄递酶染色的残余有生机的肿瘤是相关的。增强谐波宽频灰阶声像图提供的结果与组织病理发现和诊断标准是一致的，声像图探察消融后残余肿瘤的敏感性、特异性分别为83.3% (5 of 6) and 100% (66 of 66), respectively(表2).
长期随访
我们用增强CT随访了62个肿瘤（66个肿瘤在增强谐波宽频灰阶超声检查上认为没有血管残留，但是4个肿瘤接受了手术切除）15个月，没有残余肿瘤发现。

表1. 手术切除病例的增强谐波宽频灰阶超声检查与组织病理发现
*如果在动脉期或门静脉期发现多血供的区域，就考虑残余存活肿瘤存在。
+如果消融区没有任何组织化学染色（乳酸脱氢酶染色、NADPH 黄递酶染色）是阳性的。则考虑完全坏死。

表2. 增强谐波宽频灰阶图像探察残余肿瘤与组织病理发现比较的敏感性与特异性
敏感性83.3% (5 of 6) an特异性 100% (66 of 66)，阳性预测值100％（5 of 5），阴性预测值98.5％（66 of 67）。
讨论
本研究显示增强谐波宽频灰阶超声检查评价肝细胞肝癌射频消融后残余血管很有用：以声像图为基础的诊断与组织病理评价有很好相关性。
射频消融的能量可以导致局部的干燥和细胞的坏死。在应用射频消融能量时高频的交流电从电极进入电极周围的组织。组织内的离子试图跟随这种交流电的方向的改变，在组织中产生摩擦热。当组织中的温度升高超过60摄氏度时，电极周围逐渐形成凝固性坏死区。经皮肿瘤的射频消融作为一种局灶性肝脏恶性肿瘤（例如转移性肝癌和肝细胞肝癌）的治疗手段，已经用于临床试验。这种接受的成功依赖于肿瘤的完全破坏，它在理念上应该使用最小的插入电极通过一次治疗来实现。
肝细胞肝癌射频消融的临床评价一般认为需要整个肿瘤完全破坏。在过去，常规灰阶超声和能量多普勒超声检查主要用于引导电极的放置。对于随访的影像，大多数作者依赖增强CT和增强MRI来鉴别完全凝固区和残余未消融灶。
增强CT是消融后肝脏肿瘤随访的主要影像方法。在对消融反应不完全需要额外治疗的病人，CT检查可能在协助将电极放入残余有活力的肿瘤部分是有用的。在消融后2周，不增强的凝固区清晰度增加，形成锐利的边缘。然而，在消融后几天，在增强图像上，消融周边良性组织的增强常常围绕着消融带，这种发现被认为是对热损伤细胞的炎性反应。消融周边组织的增强偶尔也会被认为是残余的肿瘤。
尽管常规的灰阶超声在引导射频消融电极的实时置入肿瘤上有帮助，消融后的超声发现是变化的，并且与坏死的形状、大小之间没有很好的相关性。以前的研究描述了利用经静脉给超声造影剂提高常规彩色和能量多普勒超声敏感性的可能性；然而，这种接受探察肿瘤的敏感性只有50％。其他一些研究者报道增强谐波能量多普勒超声评价肝细胞肝癌的血管是有效的，因为，与常规的增强能量多普勒超声相比，这种接受产生的能量多普勒伪像很少。然而，在这些方法中，造影剂的流动有时会超出肿瘤的范围，造成对有生存力的组织估计过大。
增强相位反转的谐波宽频灰阶超声检查是一种有希望的新技术，它显示微泡有很高的敏感性，并减少了伪影。谐波宽频成像技术的优点是不需要过滤就可排除来自正常组织的基波成分的信号；在对接受的信号总和后，可获得高的信噪比的二次谐波信号，这样增强分辨率提高了。已经有关于利用增强相位反转的谐波宽频灰阶超声检查来探察经导管动脉栓塞化疗肝细胞肝癌的治疗效果的报道。
本研究使用上述超声技术来评价肝细胞肝癌射频消融后残余有生存力的肿瘤。在消融前，所有的肝细胞肝癌结节在增强谐波宽频灰阶超声检查的动脉期或门脉期都显示肿瘤增强。在动脉期，由肝动脉循环供给的肿瘤血管是首选出现增强的区域；在门脉期，肝细胞肝癌结节持续增强直到经过肿瘤的动脉血流开始消失。
由于肝动脉及门静脉血流的共同作用，肝实质在门脉期也增强。结果，肝实质的强化与肝细胞肝癌的强化的差别在门脉期变得不很清楚了。在射频消融后肿瘤血流完全消失的病灶，在动脉期没有探察到动脉血流，在门脉期也没有探察到强化的肝细胞肝癌肿块。结果，这些没有生存力的肝细胞肝癌病灶在门脉期显示为圆形或卵圆形的边缘清晰的灌注缺损区。相反，残余的肝细胞肝癌病灶门脉期在肿瘤内可以看到多血供的区域。以前，关于这些区域是否与组织学证实的残余的肝细胞肝癌组织有关没有正式的研究。在这里，我们报道了基于超声发现所进行的诊断与组织病理评价之间有很好的相关性。而且，射频消融后1月，在增强超声检查上被评价为没有血管的所有肿瘤都用增强CT进行了长15月的随访，以避免采样失误。射频消融后1月，增强谐波宽频灰阶超声检查鉴别残余的肿瘤敏感性、特异性分别为83.3% (5 of 6)、 98.5% (66 of 67)。
我们的发现与Meloni et al and Wen 等报道的结果是一致的，这两组报道的超声检查的敏感性、特异性均很高，而且与CT的敏感性、特异性相当。因为在本研究中我们没有比较增强谐波宽频灰阶超声检查与双期增强CT，因此作为一种可选择的诊断方法在增强超声取代CT轴位图像以前，还需要进一步的研究。然而，射频消融后超声造影剂的使用可以比其他的影像检查提供更多的好处，例如，可以利用超声引导的方法利用超声增强来引导残余未治愈的病灶的再次治疗。因为第二代造影剂配有硬的外壳，且微泡可以在超声检查时探察的时间更长，所以当需要对残余肿瘤病灶进行再次治疗时，其他的造影剂，例如声诺维可以用作超声实时增强。
我们认为增强谐波宽频灰阶超声检查可以被用于鉴别增强谐波宽频灰阶超声检查肝细胞肝癌病灶的有生存力的部分和坏死部分，因此可能减少在治疗过程中利用CT检查来评价射频消融效果的需要。这种技术在引导附加的其他治疗时也有用，例如经皮注入无水酒精和射频消融治疗。