求助，巨噬细胞怎么转染？
Q：目前试了lipofectmine2000，磷酸钙，还有翌圣的脂质体转染试剂，转染RAW264.7和BMDM效率都很低。我一般在转染前24小时铺板，6孔板铺30万或50万/孔，转染试剂用量都按照说明书，哪位比较有经验可以分享一下实验方法，谢谢!
A1：操作方法如下:
1、BMDM巨噬细胞置于 6 孔板中；
2、密度为 2.5 × 105细胞；
3、细胞转染密度为 70%；
4、10 µL siRNA (100 pmol/mL) 和10ul转染试剂室温混合恒温 15 分钟；
5、然后加入含有 1ml 的正常 DMEM培养基到 6 孔板；
6、24 小时后换成新鲜 DMEM培养基继续培养；
A2：这个细胞就是比较难转染，需要多摸索条件，实在不行用病毒吧
Q：PMG36e质粒使用方法有吗，包括转化与链接别的片段。实验总是出错。转化细菌生长慢，链接感觉连不上。
A1：以下是一般的PMG36e质粒使用方法的概述，包括转化和链接其他片段：
1. 质粒制备：首先，需要从PMG36e质粒源中提取质粒DNA。这可以通过常规的质粒提取方法（例如迅速碱裂解法或商用质粒提取试剂盒）来完成。
2. 质粒验证：在使用PMG36e质粒之前，确保进行质粒验证。这包括验证质粒的大小、线性性以及所需的限制酶切位点等。这样可以确保你使用的质粒是正确的，并且符合实验要求。
3. 转化细菌：使用合适的转化方法将PMG36e质粒导入目标细菌中。常见的转化方法包括化学转化、电转化和热激转化等。确保选择适合你实验目的和细菌菌株的转化方法，并根据相关文献或经验确定转化的条件。
4. 质粒链接：如果你需要将其他片段链接到PMG36e质粒上，可以使用限制酶消化和连接方法。通过选择适当的限制酶，将目标片段与PMG36e质粒酶切，并使用DNA连接酶将两者连接在一起。确保在连接过程中遵循正确的温度、时间和酶的浓度等条件。
5. 实验出错和细菌生长：如果你的实验经常出错或细菌生长缓慢，可能有几个原因。可能是转化效率低，你可以尝试优化转化条件，例如优化电转化参数或尝试不同的化学转化方法。另外，质粒链接问题可能是由于酶切和连接条件不正确导致的。仔细检查酶切位点和连接方法，确保操作正确。
A2：1.质粒先5000rpm离心1min，以使壁上的质粒聚集管底；
2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态，置于冰上解冻，并做好标记；
3、取2μl质粒加至100μl感受态中，冰浴30min；
4、42℃热激90s，再冰浴5min；
5、加入900μl无抗的LB液体培养基，220rpm震荡培养1h；
6、6000rpm离心5min，仅留100ul上清,并混匀菌体沉淀；
7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，用涂棒涂匀；
8、将平板正向培养1h，再倒置培养培养12-16h；
9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12-16h，根据实验需要提取质粒。
注意事项：
1.转化前请准确查找该质粒相应的抗生素名称、抗生素使用浓度、感受态名称和培养温度。
2.如果是甘油菌种，请先四区划线，挑取单克隆培养。
3.如果第二天转化平板长的过多，将质粒按比例稀释后再转化。
Q：荧光微球孵育的巨噬细胞可以用显微镜观察吗？
A1：是的，荧光微球孵育的巨噬细胞可以使用显微镜进行观察。荧光微球通常具有特定的荧光标记，使其在显微镜下可见。当这些荧光微球被吞噬或附着在巨噬细胞表面时，您可以使用荧光显微镜来检测和观察这些细胞。
通过使用适当的荧光显微镜滤光片或滤波器组合，您可以选择性地激发和捕获与荧光微球相关的荧光信号。这使您能够可视化巨噬细胞与荧光微球的相互作用，并在显微镜下观察它们的位置、数量以及可能的细胞响应。
A2：可用流式细胞仪检测巨噬细胞吞噬荧光微球。
A3：荧光微球孵育之后巨噬细胞就可以用显微镜观察了
Q：如何用HPLC法测定辣根过氧化物酶中同工酶C的含量？
A1：你可以按照以下步骤进行:
1.样品制备: 从辣根组织中提取辣根过氧化物酶。可以使用适当的提取缓冲液(如磷酸盐缓冲液)将辣根样品研磨或切碎，并离心以获得澄清的提取物。
2.蛋白质定量: 使用合适的蛋白质定量方法(如Bradford法、Lowrv法或BCA法)确定提取物中的蛋白质含量。
3.样品前处理: 根据实验需求和已有的文献方法，可能需要对提取物进行一些前处理步骤例如蛋白质分离、富集或去除干扰物。
4.HPLC条件设置: 选择适当的HPLC系统和柱，并根据同工酶C的特性设置合适的分离条件，如流动相、梯度条件、流速等。也可以参考已有的文献方法进行条件设置。
5.样品注射: 将前处理后的样品以适当的注射体积注入HPLC系统中
6.检测和分析: 使用合适的检测器
A2：操作步骤
（一）HRP的制备
⒈水提取：
称取 10斤用水冲刷干净的鲜辣根（辣根皮中亦含有丰富的HRP），用菜刀切成小碎块，在搅肉机中搅碎1~2次。碎渣浆用1倍体积的水在低温下搅拌提取过夜。次日用甩干机甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取一次，合并两次滤液，量总体积和度。
⒉硫酸铵分级分离：
在不断搅拌下，每升滤液中慢慢加入226克硫酸铵粉末（相当于0.40饱和度），大约在1~2小时内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面浑浊液以3000转/分离心15分钟，弃沉淀，合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸铵粉末（0.8饱和度）随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离心机中以13000转/分离心20分钟，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀悬浮于100~150毫升蒸馏水中（加水量要使沉淀全部溶解为止），分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析1~2天，直到硫酸铵透析完毕为止（可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查）。然后改换成用蒸馏水透析，中间更换2~3次，用0.1 mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。
将透析液合并，在冰冻离心机中以 4000转/分离心 15分钟；去沉淀，量上清液的体积。
⒊丙酮分级分离：
将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至-15℃的丙酮，放置片刻，在冰冻离心机中以4，000/分离心15分钟，弃去沉淀。上清液再加入0.8体积（按原上清液体积）-15℃丙酮，（操作同上），静置后，在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中，透析除丙酮。可得Rz值近于1的酶溶液。
⒋精制：
将上步酶液适当稀释，滴加1M硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10-3M，5000转/分离心10分钟，得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，对水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冷冻干燥（约得20毫克），产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品的Rz值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保存。
HRP的活力测定
测定过氧化物酶的传统方法是连苯三酚试验法，以过氧化氢为底物，在酶作用下，连苯三酚可形成红棓酚（Purpurogallin），在430nm处测定产物的形成。用红棓酚值（PZ）表示酶的活力。PZ表示在标准测定条件下1毫克酶所形成的红棓酚微克数。
Q：求问小鼠脾脏组织通过磁珠分选后得到的CD4 naive T cell该如果培养，能否长期传代培养，培养皿是否需要用CD3包被
A1：可以长期培养，用CD3包被之后细胞会长的比较好
A2：对于培养CD4 naive T细胞，以下是一些建议：
1. 预处理培养皿：在培养皿中使用CD3包被可能是有益的。CD3是T细胞受体复合物的一部分，通过包被CD3可以提供细胞所需的激活信号，并促进细胞生存和增殖。
2. 使用适当的培养基：选择适合T细胞培养的基础培养基，例如RPMI-1640或DMEM，并添加适当的补充物，如胎牛血清（FBS）或人血清。
3. 添加生长因子和细胞因子：CD4 naive T细胞的长期传代培养可能需要添加适当的生长因子和细胞因子，如白细胞介素-2（IL-2），以促进细胞增殖和生存。
4. 细胞密度控制：在传代培养过程中，注意细胞密度的控制，以避免过度密集或过度稀释的情况。适当的细胞密度可以有利于细胞的生长和传代。
5. 细胞验证和鉴定：在长期传代培养过程中，定期进行细胞验证和鉴定，以确保细胞的纯度和特性。可以使用表面标记物、流式细胞术或PCR等方法进行细胞鉴定。
A3：需要用cd3包被，长期刺激，可以一直传代，但是10代以后细胞实验效果会变差
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最后编辑于 2023-06-29 · 浏览 1642
