protocol 分享｜磁珠法纯化 DNA

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简介

利用独特包埋的磁珠吸附 DNA，随后在特定溶液下洗脱从而达到分离纯化 DNA 的目的。

原理

独特包埋的磁珠，在一定条件下对核酸具有很强的亲和力，当用特定洗脱溶液洗涤时，其会释放吸附的 DNA，从而达到快速分离纯化核酸的目的。

用途

从组织、细胞或血液中快速提取 DNA；以及提取质粒 DNA。

材料与仪器

器材：磁力架、移液枪、微量离心机、涡旋仪、金属浴或水浴锅；

试剂：裂解液、磁珠、异丙醇、蛋白酶混合液、洗涤液 A、洗涤液 B、洗脱液、胰蛋白酶；

耗材：移液器枪头、离心管、组织或细胞、细胞刮、培养皿。

步骤

1. 样本处理：

组织样品：取新鲜或冷冻样本 40 mg，加入 400 μl 裂解液，研磨匀浆后，10 000 g 高速离心 5 min，取上清；将上清转移至新的离心管中，并加入 20 μl 蛋白酶混合液，涡旋振荡 10 sec，56 ℃ 孵育 10 min。

细胞样品：悬浮培养的细胞直接通过 500 g 离心 5 min 获取细胞沉淀；贴壁培养的细胞用 0.5% 胰蛋白酶消化或用细胞刮从培养皿中将细胞刮下，而后 500 g 离心 5 min 得细胞沉淀。在约含 5 × 106 个细胞的沉淀中依次加入 400 μl 裂解液和 20 μl 蛋白酶混合液，涡旋振荡 10 sec， 56 ℃ 孵育 10~30 min。

2. 将消化完毕的样本取出，置于离心管架上冷却到室温。另取一个空的离心管，加入 400 μl 裂解液和 20 μl 蛋白酶混合液作为阴性对照（可选）。每个管中依次加入 300 μl 异丙醇和 25 μl 磁珠，盖上管盖，上下颠倒离心管 5 次以混合均匀，涡旋振荡 1 min。

3. 然后静置 5~10 min，静置完毕涡旋振荡 30 sec，使磁珠均匀分布，与样品充分接触。重复此步骤一次。而后 12 000 g 离心 1 min，离心完毕将离心管置于磁力架上，静置 2 min，弃上清。

4. 加入 500~700 μl 洗涤液 A，涡旋振荡 10 sec，直至管内磁珠分布均匀。12 000 g 离心 15 sec，离心完毕将离心管置于磁力架上，静置 2 min，弃上清。

5. 重复步骤 4 两次。

6. 加入 500~700 μl 洗涤液 B，涡旋振荡 10 sec，直至管内磁珠分布均匀。12 000 g 离心 15 sec，离心完毕将离心管置于磁力架上，静置 2 min，弃上清。

7. 重复步骤 6 两到三次。

8.12 000 g 空离 30 sec，并用移液器小心地将管内残余液体吸出，打开管盖，室温干燥 2~5 min。

9. 每管加入 100 μl 洗脱液，用移液器吹吸磁珠-洗脱液混合物，以使磁珠均匀分布。65 ℃ 孵育 3~10 min。

10. 12 000 g 离心 15 sec，离心完毕将离心管置于磁力架上，静置 2 min 或直至液体变澄清。

将含有 DNA 的洗脱液转移至新的离心管中。24 hrs 内使用可储存在 2 ℃~8 ℃ 冰箱，长时间储存应置于 -20 ℃ 冰箱保存。

注意事项

1. 磁珠较为昂贵，可以重复使用，切勿用过即扔。

2. 步骤 8 中，干燥时间最长不超过 5 min，磁珠表面失去光华即可，避免干燥过度，磁珠不易重悬。

常见问题

干燥过度，磁珠成团，不易重悬。

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