请问动物组织有颜色 bca 怎么办？

丁香实验

发布于 2023-06-15 · 浏览 875 · IP 浙江浙江

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48 小时内有问必答~

Q：rt 动物肠组织多多少少会有黄色或者红色的情况导致bca od值不准进而wb上样量不稳定，这种情况该怎么破呢？稀释吗？可能会好点但还是有点颜色稍微淡一点。谢谢！

A1：多用pbs溶解冲洗，取材的时候尽量选择颜色浅的组织

A2：可以尝试以下方法来解决问题：

1. 样品稀释：尝试对组织样品进行稀释，以减少颜色的影响。适当的稀释可能有助于降低颜色的强度，提高OD值的准确性和Wb上样量的稳定性。可以逐步尝试不同的稀释倍数，选择适合的稀释比例。

2. 清洗和处理步骤：确保在处理组织样品之前，充分清洗和去除任何可能导致颜色干扰的物质。彻底清洗工作台、试管和所有使用的工具，并采取适当的措施以防止可能的污染。

3. 对照组和负空白：在进行实验时，建议设置适当的对照组和负空白，以帮助排除颜色干扰的影响。对照组可以是没有特定蛋白质的样品，用于评估颜色对OD值和上样量的影响。

4. 其他检测方法：如果颜色干扰仍然存在，并且影响结果的可靠性，可以考虑尝试其他蛋白质检测方法，例如ELISA（酶联免疫吸附法）或其他适合的检测技术，以获得更准确和稳定的结果。

Q：病例对照的话，编辑说实验对象不明确，要如何修改呢？

A1：在病例对照研究中，研究对象的选择应遵循：代表性和可比性原则。

1. 代表性原则：

病例组应能够代表目标人群中患该病的总体；

对照组应能够代表目标人群中未患该病的总体。

2. 可比性原则：

除了需要研究的因素外，在一定情况下，病例组和对照组在性别、年龄、社会经济文化等方面应均衡可比。

在此基础上，病例组和对照组的选择更应注意以下几点：

1. 病例组：

1）病例的诊断必须正确；

2）被选择的病例应具有暴露于研究因素的可能性，否则应予排除。

2. 对照组：

1）采用与病例组相同的诊断方法确诊未患该疾病，避免对照组中混入轻型病例；

2）具有被研究“暴露因素”的接触机会；

3）尽可能与病例组对象同源，例如：来自相同的医院或社区等；

4）若环境影响疾病的发生，对照组不要来自病例组同一环境。

3. 在病例-对照研究中，最常缺乏的就是两组基线的比较，若基线不可比，易引起混杂性偏倚。

4. 对于纳入病例是否为初诊患者，应根据研究目的确定。

1）用于病因学研究或筛检试验效果评价时，纳入新发病例可以减少回顾性偏倚；

2）用于治疗效果评价时，应根据研究目的不同，不一定都纳入初诊病人；

3）研究某药物对结核复治的疗效时，显然就不能纳入初诊患者；

4）在任何情况下，研究者应指明病例组是否为新发病例及纳入时病例组所处于的病程阶段。

Q：本人是新手，今天第一次做ELISA试剂盒测IL-1β，样本是细胞培养上清液，测的标准曲线和四个组的样本(一个复孔，共8个孔)，标准品显色很好，r2=0.9919，但是样本的8个孔都没显色，测的od值都低于标准品空白组，请问问题出在哪里

A1：1.包被原：包括你的包被液有无问题，有没有配错。包被原一般加100微升，37度2小时；

2.封闭：封闭液用的是否适合？你说做了几次都没显色，空白孔也不显吗？如果空白也无颜色，那封闭就没有问题。一般封闭是200微升每孔，也可以满孔封闭

3.一抗：检查你的一抗是否失效。是否是在37度反应

4.二抗：底物，底物缓冲液……这些都要好好检查！

5.洗涤：用PBST洗涤，包被和封闭时洗板3次；一抗二抗洗涤5次，每次间隔3分钟。手工和机器洗涤没什么不同，就是省力一些。洗5次不会有负影响，在一抗和二抗洗涤过程中，恰恰需要多洗几次，这样有助于减少非特异性吸附。

A2：样品浓度太低，或者样品存在降解，建议重新加样

A3：样品孔不显色，可能是样品中的细胞因子或所测物质含量较低，难以检测出来

A4：出现这种情况可能有以下几个原因：

1. 样本浓度太低，低于试剂盒的检测范围。建议在下一次实验中细胞培养时间延长，这样可以提高样本浓度，并设置不同的浓度梯度。

2. 样本中存在干扰物质，如胆固醇、脂质等。这些物质可能会干扰ELISA试剂盒的结果。建议进行样本预处理，如进行脱脂、去除中间产物等处理。

Q：WB蛋白趋势对，但是条带大小大了15-20kda,不知道怎么回事

A1：有可能是mark的问题，换个别人的试试看

A2：可能是蛋白形成了多聚体，或者部分形成了二聚体，所以条带大小变大了

A3：有以下几个可能的原因：

1. 蛋白修饰：某些蛋白可能经历多种修饰，如磷酸化、甲基化或糖基化等，这些修饰可以增加蛋白的分子量。因此，如果目标蛋白发生了这些修饰，条带的大小就会增加。

2. 多聚体形式：一些蛋白质可以以多聚体形式存在，如二聚体或多聚体。多聚体形式的蛋白通常具有比单体更大的分子量，因此可能导致观察到比预期大的条带。

3. 空间构象或聚集状态：某些蛋白在非还原条件下可能形成聚集体或具有特定的空间构象，导致条带在SDS-PAGE凝胶中迁移速度较慢，从而显示出比预期大的分子量。

4. 技术问题：在实验过程中，可能出现技术问题导致条带大小异常。例如，蛋白样品加载量过多、电泳条件不准确、缓冲液或试剂配制错误等。

Q：请教一下师兄师姐：我尝试跑了大鼠的肠组织，总之要么有的样本没有内参，要么有内参但是内参老是调不齐。。。有什么好的解决方法么。。。据说刮肠绒毛可以保证细胞单一性好些。。容易内参齐？我的样本基本上收了后冲掉粪便，然后液氮、-80,2-3天内取出裂解取上清BCA后制样跑wb，这样操作的（据说肠内容物复杂，容易降解蛋白）谢谢

A1：动物肠组织要消化好，细胞的纯化度越高内参越容易跑，多种细胞混合内参很容易不齐，建议延长消化时间，提高细胞纯度

A2：多半是做胶没做好导致的。一个是蛋白抽提后，没有认真去做蛋白定量，也就是没有大约摸定一下蛋白有多少浓度，导致上样量不一致。当然，就按照内参压出来的浓度来调整上样量就行了。不过，一定要注意的是，这个是在条带差距不大的情况下使用，要是真的内参差异特别大，还需要有别的考量。还有一种就是内参都特别深，没有比较的意义，WB压片也是有范围的，如果做标曲的话，也就是说尽量使用线性区范围浓度的上样量，别浓度太高，导致没法分析，这种时候需要降低点上样量。

A3：首先，内参不稳定的问题可能与以下几点相关：

1. 内参的选择：对于肠组织，一般会选择β-actin、GAPDH或者Tubulin作为内参。需要注意的是，不同的组织、不同的处理方式，所选用的内参也可能有差异。一般来说，你可能需要试验多种内参来确定哪种最稳定。

2. 样本处理和蛋白质提取方法：尽可能快速冷冻组织以减少蛋白质降解。确保在提取蛋白质时的破碎充分，蛋白质完全提取。提取过程中尽可能低温并快速进行，以及添加足够的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。

3. 制备裂解液时要根据实验的需求来，有些研究可能需要用含有SDS的强裂解液，有些则需要用温和一些的裂解液。此外，裂解液中的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂也非常关键，能有效防止蛋白降解。

4. 蛋白质浓度的测定：BCA法测蛋白质浓度比较准确，但仍需谨慎操作，避免测定误差。

有关于“刮肠绒毛”的问题，刮肠绒毛的确能够获得更纯净的上皮细胞样本，从而可能使内参更加稳定。但是，这需要在动物实验阶段就进行操作，并且需要一定的技术手段，不一定每个实验室都能够进行。你提到的“肠内容物复杂，容易降解蛋白”的问题，实际上刮肠绒毛能够有效地解决。