经验分享 | PCR 引物设计的十大黄金法则（看到就是赚到）

好的引物会让 PCR 实验成功一半，引物设计一直都是PCR非常重要的环节。然而，当实验室小白遇上引物设计，往往一片迷茫，不知所措……

今天，大师兄给大家总结了 PCR 引物设计的 10 条黄金法则，可谓经典当中的经典，看到就是赚到！

引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计

DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对，各基因相同的序列就是该基因的保守区。

引物长度一般在15~30碱基之间

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

引物 GC 含量在 40%~60% 之间，Tm值最好接近 72℃

上下游引物的 Tm 值是寡核苷酸的解链温度。有效启动温度，一般高于 Tm 值 5~10℃，其 Tm 值最好接近 72℃ 以使复性条件最佳。

引物 3′ 端要避开密码子的第 3 位

如扩增编码区域，引物 3′ 端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

引物 3′ 端不能选择 A，最好选择 T

当末位链为 T 时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于 A、T 之间，所以 3′ 端最好选择 T 。

碱基要随机分布

降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

引物自身及引物之间不应存在互补序列

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。

引物的 5′ 端可以修饰，而 3′ 端不可修饰

引物 5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等，引物的延伸是从 3′ 端开始的，不能进行任何修饰。

扩增产物的单链不能形成二级结构

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

引物应具有特异性

引物设计完成以后，应对其进行 BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一，光是在引物设计这一步，就非常考验耐心和细节。好在丁香实验早就给大家整理了好了关于 PCR 的实验方法、步骤、经验等精华内容，还有问答广场，实时帮助大家解决遇到的实验问题，48 小时内给出解决方案！

「那么，问题来了」

科研提问活动 · PCR 专场

活动时间：6 月 6 日 ~ 6 月 19 日

主题：PCR 类相关科研实验

如果你最近刚好在进行 PCR 引物设计，荧光定量 PCR，RT-PCR……等等PCR 相关科研实验！那么，千万不要错过啦活动期间，在丁香实验平台上，抛出你的实验问题，就能得到由赛默飞赞助的科研好礼！

这一次的奖励，包括了：夏日清凉小风扇、实验计时器、丁香园加薪水陶瓷杯等实物奖励，还可获得丁当奖励，在丁香商城兑换心仪的礼品哦~

那么，问题来了！

怎么才能获得这些奖励呢？

Step 1：

进入论坛【基础科研】任一板块，点击顶部【去提问】按钮输入问题，选择关联「PCR 领域」的实验，点击提交。

（点击大图查看提问指导）

Step 2：

等待自己的提问发布后，戳下方文字填写地址，坐等奖品发货就这么简单！

>>>点此填写收货地址<<<

（请勿提前填写，工作人员会一一进行校对）

获奖攻略：

活动期间发布提问

发布 1 个提问：实验计时器

发布 2 个提问：20 丁当

发布 3 个提问：夏日小风扇

除此之外，丁香实验还将对大家的提交的问题进行评选，提交的实验问题，描述越具体详尽（如有实验图片可直接上传）且是真实发生在实验室当中的，就越有可能被选中哦

（优秀提问示例图）

活动期间，我们将选择 5 个优秀提问，额外送给提问者每人一个加薪水喝水杯，所有奖励将会打包发出。

（图片来源于丁香园）

举办活动的初衷是为了帮助大家解决科研实验问题，如果系统识别到一次性发布多个问题，或者非科研实验问题，一律不予发货哦，请大家公平参与！

当然了，只要是在丁香实验问答广场上抛出的问题，都会得到围观和解答，不仅仅是参与活动领取奖励，还能得到学霸天团，对自己疑惑的指导和解答，一局多得！

从现在起到 6 月 19 日都可以参与活动哦，快快来参加吧！

*说明：

1、活动最终解释权，归丁香实验所有

2、所有活动数据公平公正公开，任何违规操作刷榜行为，一经发现，将取消活动参与资格，并封禁账号，请诚信参与活动

3、活动奖励，将在 6 月 19 日活动结束后 14 天内，统一安排寄送，请耐心等待