培养攻略丨人软骨细胞永生化培养
人软骨细胞永生化复苏步骤
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
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人软骨细胞永生化传代操作
如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02% EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有永生化人软骨细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化2-5 min（视细胞情况而定），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分能轻轻吹下并脱落，迅速拿回操作台，加2-3ml完全培养基终止消化。轻轻吹匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
c、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
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人软骨细胞永生化冻存步骤
待人软骨细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×10^6~1×10^7/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮罐储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
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温馨小贴士
1.运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞
2.收到细胞后第一次传代建议1：2传代
常见问题
1
何时须更换培养基
视细胞生长密度而定，常规细胞2-3天更换培养基。
2
何时进行传代
细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养
首次传代建议1：2传代，就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。
3
细胞冻存浓度是多少
1*10^6-1*10^7之间都可以。
