新手原代原代星形胶质细胞提取及培养经验交流

准备材料：新生1～3天的小鼠，含10％的deme/f12培养基，40u/ml多聚赖氨酸包被培养瓶（pbs三遍，然后紫外线照40min左右），预冷的deme/f12培养基或hbss，0.125％胰酶，全程超净工作台冰上操作

步骤：

①小鼠冰块麻醉，酒精浸泡消毒

②断头，分离颅骨，脑组织浸泡在含有预冷的DMEM培养基或hbss中

③显微镜下剥离大脑表面的脑膜、血管，分离出皮层转至另一个含有预冷的 DMEM 培养基或hbss培养皿中。

④0.125%胰蛋白酶消化10-15 min，之后加入同体积含血清培养基终止消化

⑤收集到离心管中，1000rpm离心5-8min，弃去上清。

⑥含血清培养基重悬细胞，接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶中，37℃，5%CO2，90%湿度的细胞培养箱中培养。

⑦每3天更换一次培养液，培养10~15天左右，37℃，190 rpm/min振摇18hr，去除小胶质细胞和少突胶质细胞。

我一般用4个新生c57接种1个t75或者3个t25。

0.25胰酶我用pbs稀释到了0.125大概10～15分钟，消化过程中一定要镜下观察，千万别消化过了（血泪教训）。

多聚赖氨酸用三蒸水稀释到了40u/ml，包被大概四五个小时或者过夜，我感觉前天晚上接种第二天早上看就贴壁了。

提纯后多少代以内做实验合适呀，还是提完立马做？