脐带间充质干细胞的分离与培养（一）

1.实验材料

PBS(含1%双抗)，双抗，间充质干细胞培养基，

16cm直全齿止血钳2把、16cm直尖剪刀1把、中号弯盘1个、带钩医用组织镊，10cm培养皿、T75培养瓶、刻度移液管（5ml、10ml）、电动移液器等

2.脐带间充质干细胞的分离

2.1在生物安全柜内，向培养皿中加入适量PBS。小心将脐带放入培养皿中，剪去结扎的端部。将脐带剪成不超过10cm的小段，挤出残留的血液（尽量洗净血液）。将脐带小段转入新的培养皿中，加入适量PBS，充分洗涤，再将脐带剪成约3cm的小段。

2.2取脐带小段至弯盘或培养皿中，止血钳夹住一端横截面端部组织，用另一把止血钳夹住外壁，将其撕脱开来（去除表层），同时去除暴露的2根动脉和1根静脉。将剩余的华通式胶充分剪碎，使其成为体积约为1～2mm3的小块。

2.3根据剪碎组织的体积，加入间充质干细胞培养基，并按照3ml/瓶将组织混悬液加入到T75 培养瓶中，将组织摇匀（底面尽量均匀，也可用小勺先将组织移入瓶内铺匀静置5分钟再加培养基），每根脐带约接种5～10瓶T75。将培养瓶放入37℃，5%CO2培养箱中培养。

3.脐带间充质干细胞的原代培养

3.1植块接种后1～2天，每瓶补充5ml 培养基。第7～9天更换培养基，操作时轻拿轻放，培养瓶略微抬起，让培养基流入底部，将其吸弃，并按照5ml/瓶加入新的培养基。

3.2培养至第12～16天左右，镜下观察，50%以上的组织块周围爬出细胞且局部汇合度在80%以上时，可以考虑收集组织，进行细胞传代及组织再植。培养期间，尽量减少移动培养瓶。

“细胞版2月活动”

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P5代细胞形态