TA克隆篇

TA克隆是指利用片段两端带有腺嘌呤A，与两端含有胸腺嘧啶T的载体进行连接、重组、构建载体的方法，该法在1988年出现经改进后成为常用克隆技术之一。

TA克隆在这三种常用克隆类型中最简单的，TA克隆法引物设计相对简单，只要引物参数好，用耐热性DNA聚合酶进行片段扩增即可，因为耐热性DNA聚合酶会在两端加上腺嘌呤A，如用taq酶进行片段PCR扩增，得到的产物是两端具有腺嘌呤A的片段，再连接到T载体上即可。

然而事情并没有那么简单，T载体的制备是比较繁琐的。本篇内容主要重点要放在T载体的制备过程中，T载体主要的制备方法有3种：

酶切法构建T载体：

• 用单T的内切酶，切出线性化T载体，如限制性内切酶XcmⅠ。此方法的局限性是大部分载体没有XcmⅠ位点，就算有酶切位点也很可能不符合目的基因插入位置。所以目前很多公司都通过改造载体，在载体上认为添加XcmⅠ酶切位点。

平末端酶切后加T：

• 通过平末端酶切出平末端缺口，再用taq酶以及dTTP混合体系处理便可在两端加上T。平末端酶相对较多，如AfeI酶、BsaAI、EcoR V酶等，更多平末端酶参考：Recleavable Blunt Ends | NEB 平末端酶切后加T比直接切出T载体拥有更多位点选择，因此其成为制备T载体的常用手段。

PCR线性化后加T：

• 在具体想插入位置，设计载体线性化引物，通过在平末端引物线性化载体，再通过taq酶以及dTTP混合体系处理便可在两端加上T。此种方法不受任何酶切位点限制，灵活自由，适用在几乎所有质粒制备T载体。

载体加T后，为了降低自连率，通常将加T的载体进行5’端去磷酸化处理，直接购买去磷酸化酶（如碱性磷酸酶CIAP）处理即可。

TA克隆片段引物：直接选择参数较好的引物就行，不必加酶切位点和任何修饰。

• 实验操作：

1. 将两端带有腺嘌呤A的片段与T载体混合，加入T4连接酶12-16℃过夜连接。
2. 将产物直接转化到感受态中；
3. 涂板并培养；
4. PCR鉴定以及测序。

三种主要克隆方法我都常用，TA克隆看似简单，但是出了问题很难找到原因，所以我还是最钟情于同源重组法。