【经验分享交流】TA克隆

研一实验室小白，做分子克隆同时掌握基础实验操作技能，谈谈这两三个月做TA克隆的经验，欢迎大家交流～

内容主要是以下几步：

1、PCR扩增目的条带 

2、跑胶（去杂纯化）

3、纯化的目的片段+T载体连接 

4、转化，得到蓝白斑

5、取白斑

6、摇菌

7、菌液PCR（琼脂糖凝胶估测浓度）

8、提质粒

9、单酶切

10、琼脂糖凝胶电泳

11、测序有无突变

一、感受态制备

实验室用的感受态细胞都是自己制备的，非商品化，氯化钙法和PEG8000法这两种制备方法都试过，比较而言，前者更加省时。有几点比较容易影响转化效率的注意事项：

①：菌液OD值在0.4-0.6之间时最佳，此时处于生长对数期；

②：实验在低温、无菌的环境中进行，操作要温和，避免剧烈震荡。细胞膜通透性变大会变得脆弱，低温环境可以提高细胞存活率；

③氯化钙使用前预冷；

④：-80℃低温保存。

二、连接，转化

目的基因扩增时，最好选高保真的LA Taq酶。PCR产物最开始是切胶纯化回收，后来买了omega纯化试剂盒，不用跑胶，从PCR仪里拿出来直接就可以纯化啦。

T载体和目的基因连接选择合适的连接比例，1:1到1:10，可以多试几个

自己摸索最佳比例。

公式：

目的片段量（ng）*载体大小（kb）=载体量（ng）*目的片段（kb）*摩尔比

转化率高低还和目的片段自身特性有关，DNA越小转化率越高。

T4 DNA 连接酶 28℃连接1.5h和16℃连接过夜，两种连接方式都连上了。

导入DH5α感受态，涂板，37℃温箱培养12-14h。第二天板子上菌落白白胖胖胖胖，分布均匀，皆大欢喜，不过也可能碰到过一下几种情况：

①单菌落蓝色和白色不容易分辨，有些看似白斑但又有一丝泛蓝，可以把板子封好口放在4℃一段时间后再挑菌，蓝白差别会非常明显。

②菌落少甚至没有。首先要确保感受态细胞是好的，板子氨苄抗性，其次连接比例可能不合适。

③卫星菌落。几种可能原因：氨苄浓度过低，板子太营养，培养时间太长。小菌落一般是不含转化的质粒的，挑中间大的单克隆菌落。

三、验证T载体和目的片段是否连接成功：

①：蓝白斑筛选：在氨苄抗性板子的基础上，蓝白斑筛选可以直接排除大量的非目的重组体，但还只是粗筛。

②：菌液PCR：以菌体热解后暴露的DNA为模版，一条引物用载体，一条引物用目的基因上的。同时挑的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。（假阳性率高，这步一般省略不做）

③：摇菌，提质粒，单酶切，跑琼脂糖凝胶电泳，T载体和目的基因的两条带位置大致正确的，送测序看有无突变。

不过我还是有个疑问，我的目的基因1686bp，单酶切后跑电泳，目的条带在1800bp左右，测序结果插入片段大小1877bp，含目的基因，为什么条带会变大呢？