质粒转染全步骤个人小总结

趁着有一点空闲时间跟大家分享一下我最近关于质粒转染的实验心得。
一、首先质粒菌液是广州艾基生物公司提供的,价格比较公道,这对我们这种缺钱的小课题组来说很重要,但是 构建周期略长,前后花了将近两个月,可能人家公司把我遗忘了。
二、其次质粒的提取,我们使用的TIANGEN的无内毒素小量提取试剂盒(含有内毒素的试剂盒提取的质粒溶液会严重影响细胞状态)
菌液培养步骤如下:
①LB肉汤培养基制备:
称取6gLB肉汤粉末,加入300mL已高压的超纯水,水浴溶解。121℃高压15min,4度保存。
②菌液制备:
甘油菌加入到5mL LB肉汤培养基,在37℃、220rpm的恒温摇床孵育3h,再加入LB肉汤20 μL培养基至30mL,再在37℃、220rpm的恒温摇床孵育17-21h(实际操作孵育了20h,最好不要超过24h,否则细菌会老化),直至菌液呈浑浊状态(看不清离心管对面管壁)。
③氨苄青霉素的制备:
称取0.5g氨苄青霉素粉末,置于15ml灭菌离心管中,加入4mL无菌水充分溶解定容至5mL,0.22um滤膜过滤除菌,小份分装,置于-20℃保存(用来筛选特定细菌)。
④质粒提取试剂盒提取:
1. 柱平衡步骤:向吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中)加入500 μl的平衡液BL,12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)
2. 取5-15 ml过夜培养的菌液加入离心管中,12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min尽量吸 除上清。 (20μL甘油菌+30mL LB培养基(含25μg/mL氨苄青霉素))
注意:菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。收集的菌体量以 能够充分裂解为佳,菌体过多裂解不充分会降低质粒的提取效率。
3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入500 μL溶液P1(请先检查是否已加入RNase A),使用 移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。(500μL溶液P1)
注意:如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
4. 向离心管中加入500 μl溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。(500μL溶液P2)
注意:温和地混合,不要剧烈震荡,以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠, 所用时间不应超过5min,以免质粒受到破坏。如果菌液没有变清亮,可能是由于菌体过 多,裂解不彻底,应减少菌体量。
5. 向离心管中加入700 μl溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,此时会出现白色 絮状沉淀。12,000 rpm (~13,400×g ) 离心10 min,此时在离心管底部形成沉淀。 (700 μL溶液P3)
注意:P3加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再 次离心后取上清。
6. 将上一步收集的上清液分次加入吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中,其容量为750- 800 μl ),注意尽量不要吸出沉淀。12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min,倒掉收集 管中的废液,将吸附柱CP4放入收集管中。
7. 可选步骤:向吸附柱CP4中加入500 μl去蛋白液PD,12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP4重新放回收集管中。 如果宿主菌是end A+ 宿主菌(TG1,BL21, HB101,JM101, ET12567等),这些宿主 菌含有大量的核酸酶,易降解质粒DNA,推荐采用此步。 如果宿主菌是endA- 宿主菌(DH5α,TOP10等),这步可省略。
8. 向吸附柱CP4中加入600 μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇),12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP4放入收集管中。
9. 重复操作步骤8。
10. 吸附柱CP4放入收集管中,12,000 rpm(~13,400×g )离心2 min,目的是将吸附柱中残余 的漂洗液去除。
注意:漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实 验不受残留乙醇的影响,建议将吸附柱CP4开盖,置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸 附材料中残余的漂洗液。 (10min)
11. 将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300 μl洗脱缓 冲液EB,室温放置2-5 min,(3min) 12,000 rpm(~13,400×g )离心2 min,将质粒溶液收集到离 心管中。
注意:洗脱缓冲液体积不应少于100 μl,体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗 脱效率有很大影响。若后续做测序,需使用ddH2O做洗脱液,并保证其pH值在7.0-8.5范 围内,pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,再次离心。
⑤质粒DNA浓度及纯度检测
得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为单 一条带,也可能为2到3条DNA条带,这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等 有关。OD260值为1相当于大约50 μg/ml 双链DNA。 OD260/OD280比值应为1.7-1.9,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用ddH2O,比值会偏 低,但并不表示纯度低,因为pH值和离子存在会影响光吸收值。
DNA浓度:562.3ng/μL
OD260/OD280:1.88
OD260/OD230:2.05
注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1.溶液P1在使用前先加入RNase A(将试剂盒中提供的RNase A全部加入),混匀,置于 2-8℃保存。
2.使用前先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊,如有混浊现象,可在37℃水浴中加 热几分钟,即可恢复澄清。
3.注意不要直接接触溶液P2和P3,使用后应立即盖紧盖子。
4.所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心,速度为12,000 rpm (~13,400×g )。
5.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或 大于10 kb的大质粒,应加大菌体使用量,同时按比例增加P1、P2、P3的用量,洗脱缓冲液应在65-70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间,以增加提取效率。
6.实验前使用平衡液处理吸附柱,可以充分激活硅基质膜,提高得率。
7.用平衡液处理过的柱子最好当天使用,放置时间过长会影响效果。
8.去蛋白液PD可以有效去除残留的蛋白杂质,当宿主菌为endA+(TG1、BL21、HB101、 ET1256、JM101等)核酸酶含量较高的菌株时,强烈推荐使用去蛋白液PD。
三、质粒转染
我一共使用过三种转染试剂:
(1) Cell-Box — Efficient Microfluidic Lipofectamine Transfection Reagent
(2) 四正柏生物 UltraFection 3.0 高效转染试剂
(3) Thermofisher Lipofectamine 3000 reagent
前两个转染试剂,他们公司都给我寄了试用装,总的来说,转染小片段非常合适(不是打广告,我跟他们公司不熟,而且大家都可以免费申请试用装),但是因为我转染的基因DNA片段比较长,最终我选择的还是Thermo。
操作如下:
(1) 将离心消化后的细胞台盼蓝计数接种于六孔板中(我一开始预试使用的24孔板,正式实验因为需要较多的细胞,所以直接在六孔板里转染),每孔70万,间隔六个小时以后开始转染。(不同细胞接种数量不一样,密度要求达到80-90%,说明书上写的是70%-90%,但是事实上细胞密度高一些更好,间隔6个小时是自己摸索的条件,此时细胞已经完全贴壁,状态较好,细胞数量没有太大变化)
(2) 配制转染试剂
① 125 μL OPTI-MEN +10 μL P3000 reagent+2.5 μg质粒, 混匀
② 125 μL OPTI-MEN + 5 μL Lipofectamine 3000,混匀
③ 分别将①和②混匀,室温放置15min。
(3)转染
将六孔板中的细胞更换新的培养基,加入③中转染试剂,混匀,37℃,5%CO2培养箱中感染5h。
实验中遇到的小问题及解决办法:
1. 出于省钱,在转染5h后我将含有转染试剂的培养基加入六孔板中另外一孔的细胞中,继续感染5h,在荧光下检测发现感染效率是一样的。(啊贫穷的课题组和时刻想着省钱的我)
2. 质粒转染的效率没有慢病毒转染效率高,只有50%左右,慢病毒可以达到90%以上,但是慢病毒确实价格有点贵。
3. 那么质粒转染要不要用嘌呤霉素筛选呢?我一开始是用1%嘌呤霉素筛了的,但是细胞死了很多,所以最后没有筛选直接用的,但是在做药效实验时过表达(我是用来过表达某基因的)的效果,以及蛋白表达水平,细胞功能实验出于我意料升高明显。
4. 质粒转染虽然也属于瞬转,但是在细胞中可以维持七天,甚至传四代以后荧光表达依然很强。就性价比来说的话,比小RNA效果好。
5. 为了保证实验结果的稳定性,我每次做细胞功能实验使用的均为感染第四天的细胞,确保此时感染效率比较一致。