冰冻切片和石蜡切片的免疫组化染色步骤及荧光抗体染色方法
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速冻组织
将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。
冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。
PBS洗，5分钟×3。
用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×3。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。
石蜡切片免疫组化染色步骤
三步法（以SP试剂盒为例）
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。
4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，2分钟×3次。
6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
7. PBS冲洗，2分钟×3次。
8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
9. PBS冲洗，2分钟×3次。
10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
二步法（以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例）
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3. 3% H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。
4. 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，2分钟×3次。
6. 滴加试剂1（Polymer Helper），室温或37℃孵育20分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。
7. 滴加试剂2（poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG），室温或37℃孵育20~30分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。
8. PBS冲洗，2分钟×3次。
9. 显色剂显色（DAB或AEC）。
10. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
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最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 4096
