采用慢病毒🦠转染细胞或稳转株构建

慢病毒转染/稳转细胞株的构建!

慢病毒包装和浓缩之前出过笔记啦，可以翻翻，今天讲讲怎么转染目的细胞构建稳转细胞株⚠️⚠️这个要提前做!⚠️⚠️

1️⃣确定最佳药筛浓度(以嘌呤霉素为例):每个细胞对于嘌呤霉素的敏感性不同，实验开始前要确定最佳药物筛选浓度;准备24孔板，铺板目的细胞使第二天密度为60-80%;加入含嘌呤霉素的培养基(可设置梯度0,1,2,3,4,5,6,8,10μg/ml);每天观察细胞，隔天换含嘌呤霉素的培养基，导致细胞在3-5天全部死亡的最低浓度即为最佳药筛浓度。

慢病毒转染及稳转株筛选

2️⃣转染前铺板:我一般用12或24孔板，因为病毒转染只需要2-3个孔，所以铺板的时候多铺几个密度(不要转几个孔就只铺几个孔)，铺板一定要摇匀，细胞堆起来会影响转染效率(之前有出过孔板怎么铺匀的教程)，第二天选择30-50%密度的孔进行转染就OK了~

3️⃣我一般浓缩后的慢病毒用600L重悬，分成六份，转染当天从-80取出病毒液，要转染的孔进行换液[24孔板加入500μL新鲜培基(含血清，有无双抗不影响)12孔板加1mL]，加入100μL包装好目的质粒/对照质粒病毒液，轻轻摇晃孔板使病毒液均匀分布;转染24h后撤病毒液换普通培

4️⃣转染48h后，如质粒带光可显微镜观察是否转染成功，根据抗性标记进行稳转株筛选;经过在孔板的几天，细胞也差不多长满了，我一般消化到T25筛选

5️⃣验证:筛选7-14天后，可以去荧光显微镜下看是不是每个细胞都亮，提取RNA和蛋白验证是否过表达or敲低，验证成功后可进行下一步实验~

质粒构建是成功的第一步，如果自己不会构建可以找靠谱的公司构（比如吉玛、威斯腾……），我们组一般都是找公司构，最近硅基生物在搞活动，只需0.4r/bp，就构了一个试试，跑q验证过表达了20倍，蛋白水平也过表达成功了☺️☺️

慢病毒强烈建议浓缩后使用，之前直接用粗病毒液转染效率只有40-50%，浓缩后转染效率可达80-90，可以缩短筛选的时间(阳性细胞多很快就长满了)，可以更快进行下一步实验~👏🏻👏🏻