Protocol 分享 | 细胞提蛋白步骤
1. 准备工作
开启金属浴(预热),超速离心机(4℃预冷)。
PBS洗、每孔2次,用从大到小的不同规格移液枪吸尽(1mL→100μL→10μL)。
2. 工作液配置
配方如下:
- 100U RIPA裂解液
- 1U 蛋白酶抑制剂 (Protease Inhibitor Cocktail)
- 1U 磷酸酶抑制剂 (Prosphatase Inhibitor Cocktail)
需要注意的是,通常情况下工作液配置选择前两项即可。
需要检测磷酸化时,使用磷酸酶抑制剂可维持细胞去磷酸化,并请注意在后续电泳完成后的封闭操作中,不要使用脱脂奶粉溶液进行封闭,其中含有磷酸化蛋白将对结果产生影响。
3. 细胞裂解
以六孔板为例,每孔加入100μL裂解液工作液,晃动使细胞脱落(在冰面上进行,细胞更容易裂解)。
用95%酒精预冷的细胞刮刀(用前滤纸拭干),将细胞刮至一个角落,并吸取至相应编号的EP管中。
振荡至EP管中无明显沉淀,进行离心(4℃,12000rpm,20min)。
4. 离心后处理
离心后,取上清液于相应编号的新EP管中,加入蛋白上样缓冲液。并避免吸到沉淀。
另取10μL上清液封入小EP管留样以便后续测定蛋白浓度以计算上样量(如:BCA,Bradford)。
保证上样缓冲液与上清液混合后稀释至1×即可(如使用5× SDS-PAGE蛋白上样缓冲液时,上清液取得80μL,加入20μL缓冲液即可)。
金属浴加热10min,开盖泄压,降温后封口膜封口。
5. 保存
-80℃保存。
6. 非还原性WB
若需要进行非还原性WB,应剔除反应体系中的所有还原性成分(包括电泳液),如2ME,DTT等。
同时建议将蛋白样本分为2份,1份用于还原性分析(额外加入还原剂,如2% 2ME以维持还原性环境),1份用于非还原性分析,在后续操作中应当分开电泳。
以上内容仅供参考,一些参数可根据项目需要自行调整。