Protocol 分享 | 细胞提蛋白步骤

1. 准备工作

开启金属浴（预热），超速离心机（4℃预冷）。

PBS洗、每孔2次，用从大到小的不同规格移液枪吸尽（1mL→100μL→10μL）。

2. 工作液配置

配方如下：

• 100U RIPA裂解液
• 1U 蛋白酶抑制剂 (Protease Inhibitor Cocktail)
• 1U 磷酸酶抑制剂 (Prosphatase Inhibitor Cocktail)

需要注意的是，通常情况下工作液配置选择前两项即可。

需要检测磷酸化时，使用磷酸酶抑制剂可维持细胞去磷酸化，并请注意在后续电泳完成后的封闭操作中，不要使用脱脂奶粉溶液进行封闭，其中含有磷酸化蛋白将对结果产生影响。

3. 细胞裂解

以六孔板为例，每孔加入100μL裂解液工作液，晃动使细胞脱落（在冰面上进行，细胞更容易裂解）。

用95％酒精预冷的细胞刮刀（用前滤纸拭干），将细胞刮至一个角落，并吸取至相应编号的EP管中。

振荡至EP管中无明显沉淀，进行离心（4℃，12000rpm，20min）。

4. 离心后处理

离心后，取上清液于相应编号的新EP管中，加入蛋白上样缓冲液。并避免吸到沉淀。

另取10μL上清液封入小EP管留样以便后续测定蛋白浓度以计算上样量（如：BCA，Bradford）。

保证上样缓冲液与上清液混合后稀释至1×即可（如使用5× SDS-PAGE蛋白上样缓冲液时，上清液取得80μL，加入20μL缓冲液即可）。

金属浴加热10min，开盖泄压，降温后封口膜封口。

5. 保存

-80℃保存。

6. 非还原性WB

若需要进行非还原性WB，应剔除反应体系中的所有还原性成分（包括电泳液），如2ME，DTT等。

同时建议将蛋白样本分为2份，1份用于还原性分析（额外加入还原剂，如2% 2ME以维持还原性环境），1份用于非还原性分析，在后续操作中应当分开电泳。

以上内容仅供参考，一些参数可根据项目需要自行调整。