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Protocol 分享 | 细胞提蛋白步骤

病理生理学医学生 · 最后编辑于 03-04 · IP 陕西陕西
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这个帖子发布于 2 年零 68 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。

1. 准备工作

开启金属浴(预热),超速离心机(4℃预冷)。

PBS洗、每孔2次,用从大到小的不同规格移液枪吸尽(1mL→100μL→10μL)。


2. 工作液配置

配方如下:

  • 100U RIPA裂解液
  • 1U 蛋白酶抑制剂 (Protease Inhibitor Cocktail)
  • 1U 磷酸酶抑制剂 (Prosphatase Inhibitor Cocktail)


需要注意的是,通常情况下工作液配置选择前两项即可。

需要检测磷酸化时,使用磷酸酶抑制剂可维持细胞去磷酸化,并请注意在后续电泳完成后的封闭操作中,不要使用脱脂奶粉溶液进行封闭,其中含有磷酸化蛋白将对结果产生影响。


3. 细胞裂解

以六孔板为例,每孔加入100μL裂解液工作液,晃动使细胞脱落(在冰面上进行,细胞更容易裂解)。

用95%酒精预冷的细胞刮刀(用前滤纸拭干),将细胞刮至一个角落,并吸取至相应编号的EP管中。

振荡至EP管中无明显沉淀,进行离心(4℃,12000rpm,20min)。


4. 离心后处理

离心后,取上清液于相应编号的新EP管中,加入蛋白上样缓冲液。并避免吸到沉淀。

另取10μL上清液封入小EP管留样以便后续测定蛋白浓度以计算上样量(如:BCA,Bradford)。

保证上样缓冲液上清液混合后稀释至1×即可(如使用5× SDS-PAGE蛋白上样缓冲液时,上清液取得80μL,加入20μL缓冲液即可)。

金属浴加热10min,开盖泄压,降温后封口膜封口。


5. 保存

-80℃保存。


6. 非还原性WB

若需要进行非还原性WB,应剔除反应体系中的所有还原性成分(包括电泳液),如2ME,DTT等。

同时建议将蛋白样本分为2份,1份用于还原性分析(额外加入还原剂,如2% 2ME以维持还原性环境),1份用于非还原性分析,在后续操作中应当分开电泳。


以上内容仅供参考,一些参数可根据项目需要自行调整。

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