pcr技术发展史——人类核酸研究的前世今生

人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。在此，pcr技术应运而生。

PCR(Polymerase Chain Reaction)，即“聚合酶链式反应”，是为了解决在体外特异性地扩增某个基因的问题，从而满足对核酸的体外研究和应用。

随着生物实验需求的不断发展，PCR技术在其发展的历程中，已经逐渐演化出一系列侧重于不同实验目的及应用的PCR分类，其中较为常见的包括：touchdown PCR、multiplex PCR、qPCR以ddPCR。

pcr试剂发展：

一个常规的PCR反应中所需的基本试剂组成包括：

Ø  DNA模板（template），含有需要扩增的DNA片段。

Ø  一对引物（primer），决定了需要扩增的起始和终止位置。

Ø  DNA聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域。

Ø  脱氧核苷三磷酸（dNTP），用于构造新的互补链。

Ø  含有镁离子的缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。

而现在成熟PCR试剂中，往往已将除引物和模板之外的反应试剂按照优化反应的参数配置成Mix，实验时在成品Mix中直接加入目的片段和相关引物，大大简化PCR实验中试剂添加过程。

而其中DNA聚合酶是pcr中比较重要的试剂：

在PCR技术中，DNA聚合酶起着至关重要的作用，从某种意义上说，DNA聚合酶的研究进展决定着PCR技术的发展趋势和应用范围，研究者们一直在努力探寻着酶学性能好、保真度高的PCR用DNA聚合酶。

PCR技术聚合酶发展史：

1985PCR技术首次提出

Mullis阐述了具有划时代意义的PCR技术[4]。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中提供体外合成合适的条件---模版DNA，寡核苷酸引物，dNTP，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。最初使用的大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。1985

Klenow酶：

1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等科学家发明了具有划时代意义的聚合酶链

式反应，但其最早使用的DNA聚合酶是⑶// DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生

成的C末端605个氨基酸残基片段,即Klenow酶。该片段保留了 DNA聚合酶I的5'—3'聚合酶和3'—5'

外切酶活性，但缺少完整酶的5'—3'外切酶活性。Klenow酶不耐高温，在60尤下就会很快变性失活，引物链延伸反应需在37T下进行，因此每次循环都要重新添加Klemovv酶1988年

Taq DNA聚合酶

Saiki等在黄石公园温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus, Taq) 中提取到一种耐高温DNA聚合酶[5]。该酶耐高温的性质使其热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶,从而极大地提高了PCR扩增的效率。Taq酶的发现，使得PCR真正变为现实，为其自动化铺平了道路。

Tth DNA 聚合酶

Tth DNA 聚合酶是是从嗜热性嗜热杆菌 HB8 中分离的一种分子量为 94 KD 的单亚基聚合酶，与 Taq酶相比在氨基酸序列上具有 88%的同源性，其基本特性与 Taq 酶相似，具有 5'→3' 聚合酶活性和 5'→3' 外切酶活性，不具 3'→5' 外切酶活性。最适温度在75℃，在 95℃时酶活性半衰期为 20 min。在高温条件下，当反应体系中存在 Mn2+，该酶具有很强的反转录酶活性，能有效地将 RNA 反转录成 c DNA。当鳌合了Mn2+后再加入 Mg2+，则可以使该酶的聚合酶活性增加，反转录产生的 c DNA 在此酶的作用下还可以进行PCR 扩增，使得 c DNA 的合成与扩增用同一种酶。由于普通的逆转录酶如 M-MLV、ANV 等的最适反应温度为 37℃，在此温度条件下反应，RNA 分子形成的发夹、回环等高级结构很难克服，致使反转录合成过程效率大为下降，而 Tth DNA 聚合酶在较高的温度下进行逆转录，增加了引物杂交和延伸的特异性，减少了由于 RNA 二级结构引起的问题，所以现在被广泛用于反转录－聚合酶链式反应 （RT-PCR），对于从RNA 水平检测和分析基因表达十分有用。

Vent DNA 聚合酶

Vent DNA 聚合酶是美国 New England Biolabs公司由海底火山口生长的嗜热高温球菌中分离纯化获得的，相对分子量为 85 KD。该酶具有强的 5'→3'DNA 聚合酶活性，兼有 3'→5' 外切酶活性，没有检测到 5'→3' 外切酶活性。Vent DNA 聚合酶是被分离得到的第一个具有 3′→5′核酸外切酶活性的热稳定DNA 聚合酶。3'→5' 外切酶活性的主要功能是校对作用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被 3'→5' 外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸，从而有效降低碱基错误掺入率，提高扩增结果的忠实性。因此，Vent DNA 聚合酶是一种高保真的耐热 DNA 聚合酶，其保真度比 Taq DNA 聚合酶高5~15 倍。Vent DNA 聚合酶热稳定性极好，97.5℃下半衰期长达 130 min，且该酶扩增长片断（>12 Kb）的功能较强。

Pfu DNA 聚合酶

Pfu DNA 聚合酶来自激烈热球菌。该酶分子量约为 90 KD，具有 5'→3'DNA 聚合酶和 3'→5' 外切酶活性，不具 5'→3' 外切酶活性，因此 Pfu 酶可即时的识别并切除错配核苷酸，具有理想的扩增保真度。常见热 稳 定 DNA 聚 合 酶 Vent、DeepVent、Tli、Pwo、Pfu、UlTma 等都具有校正功能，但 Pfu 酶比这些校正酶低2~60 倍的低错误率显示出极高的保真度。同时该酶也具有极高的热稳定性，95℃条件下半衰期大于 18 h，97.5℃下半衰期大于 3 h。Pfu 酶是目前使用最广泛的高保真热稳定 DNA 聚合酶，主要用于对 PCR 保真性要求较高的实验，如基因筛选、克隆表达、突变检测、定点突变等等。但此酶也存在一定的不足，如其延伸速率比 Taq 酶低近 6 倍，其原因是酶本身低的催化效率以及来自 3'→5' 外切酶活性的干扰。对于长距离模板的扩增尚不能很好的实现，一般长度在 2 Kb 内的DNA 片段扩增效果甚佳。

随着分子生物学研究的不断发展和深入，PCR 技术的应用领域也不断拓宽，对热稳定聚合酶的性能要求也越来越高。除了上述的几种 DNA 聚合酶外，现在很多生物公司利用基因重组和定点突变技术开发出了具有不同特性的、适应不同研究要求的聚合酶类型，如 Takala 公司推出的 LA Taq DNA 聚合酶和 EXTaq DNA 聚合酶，不仅聚合能力大大提高，如前者可以扩出约 30 kb 的超长片断，后者可以顺利扩出 5 kb的片断，而且均具有 3'→5' 外切酶活性，保证扩出产物的保真性。再如 Finnzymes 公司利用蛋白质融合技术将一种双链 DNA 结合蛋白（Sso7d 蛋白）与具有校对功能的热稳定 DNA 聚合酶融合，形成了一种独特的高性能的聚合酶———Phusion 高保真 DNA 聚合酶。双链 DNA 结合蛋白的存在提高了聚合酶对双链DNA 的亲和力，使得每次酶与双链发生结合反应时都能够掺入更多的核苷酸，并减少了链延伸所需的结合反应次数。Phusion DNA 聚合酶的处理能力大约是Pfu DNA 聚合酶的 10 倍，是 TaqDNA 聚合酶的 2 倍。这种强大的处理能力不仅缩短了延伸时间，而且提高了酶的扩增性能，使其能够在更短的时间里扩增更长的模板。正是这些独特的优点，使 Phusion DNA 聚合酶同时适用于常规 PCR 和要求较高的 PCR。DNA 扩增的忠实性、特异性和高效性是 PCR 成败的关键。寻找新的 DNA 聚合酶或利用生物学技术改造已有的 DNA 聚合酶，是实现或尽量提高上述 3个目标的主要手段。如何进一步提高热稳定 DNA聚合酶的酶学性能，成为广大分子生物学研究者关注的热点。对于热稳定 DNA 聚合酶的研究将使 PCR 技术更为完善，并更广泛地应用于生命科学的各项研究领域中。

Taq DNA聚合酶发现了几十年，不但没有被取代，反而在分子生物学领域具有越来越广泛的应用。这一方面依赖于它自身的功能和特点，另一方面也依赖于研究人员对其不断的进化与改造。通过定点突变、结构域重组、定向进化等技术，Taq DNA聚合酶获得了许多催化性能改善或展现新功能的突变体，拓宽了酶的应用范围，下面就来做一个回顾。

• 通过理性设计得到的突变体
• ①缺失突变体。Taq DNA聚合酶的第一个突变体就是N端删除大片段了，根据删除长度的差异，有不同的名称：KlenTaq(∆236)（Barnes, 1992），Klentaq1(∆280)（U.S. Patent 5436149），Stoffel(∆289)（Lawyer, 1993），它们本质上是一样的，都是5’-3’外切结构域缺失的突变体。N端删除Taq的耐热型、盐离子耐受能力、保真性都有所提高，但持续合成能力显著下降，对引物3’端错配的敏感性明显降低，这说明5’-3’外切结构域对酶的整体构象可能有很大的影响。研究人员发现大肠杆菌pol I后，又发现一种N端截短的Klenow片段，后者在DNA扩增上具有更好的表现，因此，研究人员得到Taq DNA聚合酶后，发现它与pol I有很多相似之处，自然而然的会进行这种尝试。根据结构或功能相似的酶对目标酶进行结构域编辑或者氨基酸替换，是一种常用的分子改造策略。
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• ②Sanger测序突变体。使用Taq作为测序酶时发现，Taq无法掺入顺利ddNTP（除ddGTP），Tabor等（Tabor, 1995）通过F667Y突变体解决了这个问题。但是Taq(F667Y)掺入ddNTPs的速率不均匀，强烈偏向ddGTP，Li等（1999）在Klentaq1与ddNTP复合物晶体结构的基础上，对R660残基进行突变，结果R660D/F667Y双突变体掺入ddGTP与其它双脱氧核糖核苷酸的速率基本一致。根据酶-底物复合物的晶体结构对酶进行理性设计是一种常用的酶进化方式，当然也比较有难度，很多时候酶-底物的晶体甚至酶的晶体不易得，即使得到晶体结构，也很难判断关键的氨基酸。通常的做法是根据酶-底物的分子相互作用，扫描活性口袋的氨基酸，这种方法经常能在增强底物亲和力、拓宽底物谱方面得到满意的结果。
• 通过定向进化得到的突变体
• 定向进化是一种十分强大的酶分子改造技术，与理性设计的“所见即所得”不同，它的的特点是“所筛即所得”。定向进化允许构建庞大的突变体库，这就让酶有了各种可能（在自然界中这可能需要几百万年以上的时间），只要找到高效的筛选方法，一般都能得到令人惊喜的结果。构建突变体的方法有易错PCR、DNA改组、交错延伸PCR、体外随机延伸PCR等，筛选一般包括初筛与复筛，初筛依靠添加筛选压力让目标突变体留存下来，复筛将留存下来的克隆进行性能比较，从而选出最优秀的突变体。筛选的主要压力来自于初筛，必须具有高通量的方法，因为突变体库多样性可达108-109，一般采用与显色化学反应，酶促反应偶联产生便于观察的信号。
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• 2001年，Ghadessy等报道了一种分区自我复制（Compartmentalized Self-replication，CSR）技术，该技术通过油水混合，形成一个个微小的油包水体系，每个体系就好像一个独立的隔离室，含有携带Taq DNA聚合酶突变体的大肠杆菌、dNTP、PCR buffer和Taq DNA聚合酶的引物，油包水体系在高温条件下仍具有很高的稳定性，通过预热变性，大肠杆菌释放出Taq DNA聚合酶，通过PCR循环，在筛选压力条件下，具有高活性的突变体以自身基因为模板进行PCR扩增，无义突变体被淘汰，反应结束纯化被富集的DNA产物，即得到了优秀的突变体基因。

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• （Ghadessy F J, 2001）CSR总体方案。 （1）在大肠杆菌中克隆并表达聚合酶基因，球形代表有活性的聚合酶分子。 （2）将含有聚合酶和编码基因的细菌细胞悬浮在含有引物和dNTP的反应缓冲液中，并分离到水室中。 （3）聚合酶从细胞中释放出来，进行自我复制。 活性低的聚合酶（白色六边形）无法复制其编码基因。释放后代聚合酶基因并重新克隆，以进行另一轮CSR。
• Ghadessy等得到两个突变体：T8（F73S, R205K, K219E, M236T, E434D, A608V），在97.5°C下的半衰期提高11倍，但催化效率和保真性有所下降；H15（K225E, E388V, K540R, D578G, N583S, M747R），对高浓度肝素抑制剂抗性提高130倍以上，但耐热性显著下降，催化活性也有下降。虽然本次研究没有得到非常优秀的突变体，但CSR技术为热稳定DNA聚合酶的定向进化提供了高效筛选方法，这种方法远比结果更有意义。
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• ③热启动突变体。Kermekchiev等（Kermekchiev, 2003）以Klentaq为模板，通过易错PCR得到突变体库，然后利用一种基于放射性dNTP标记的在位筛选方法得到一个Klentaq Cs3AC（E626K，I707L）突变体，该突变体在37℃时活性明显降低，但68℃时仍保持正常活性，是一款极具潜力的热启动酶。2009年，该团队在Cs3AC的基础上对706-708残基进行饱和扫描突变，经过筛选得到一个突变体Klentaq 10（E626K， I707L，E708K），该突变体的全血抑制抗性、土壤抑制抗性、荧光染料抑制抗性比野生酶都有提高，研究人员将三个氨基酸替换平移到全长Taq DNA聚合酶上之后，得到一突变体Taq 22（E626K， I707L，E708Q）抑制剂抗性比野生Taq显著提高。Taq 22不但获取了冷敏感特征，提高了抑制剂抗性，还保持了野生Taq的热稳定性和催化活性，如果配合TP7抗体，具有“热启动”PCR试剂盒开发的潜力。
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• ④逆转录活性突变体。野生型Taq DNA聚合酶没有逆转录活性，但Sauter等（Sauter, 2006）以KlenTaq为模板通过易错PCR和微孔板筛选，得到两个个逆转录活性提高的突变体：KlenTaq M1（L322M，L459M，S515R，I638F，S739G，E773G），KlenTaq M2（L322M，L459M，S515R，I638F，S739G，E773G，L789F）。为了将这种增强的逆转录活性用于基于探针的一步法RT-qPCR检测，Kranaster等（Kranaster, 2010）将KlenTaq M1的突变平移到全长Taq上，得到一个新突变体Taq M1，结果Taq M1即基本保留了野生Taq酶的PCR性能，又显著增强了逆转录活性。Blatter等（Blatter, 2013）进一步将M1的突变与M747K（Gloeckner, 2007）混组，得到一个新突变体RT-KTq2（L459M，S515R，I638F，M747K），RT-KTq2的逆转录能力比KlenTaq M1更强，并且DNA模板扩增能力也有所提高。RT-KTq2的高耐热性有利于提高RT-PCR的特异性，RT-KTq2无RNase H活性，降低了RNA损伤，因为兼具DNA聚合酶活性，可以实现了逆转-扩增一酶化。Blatter等用RT-KTq2对几个人源基因进行的基于SYBR的RT-qPCR检测，得到了不错的扩增曲线，但作者没有与商品化MMLV/Taq逆转录试剂盒对比，如果RT-KTq2能达到或接近MMLV的逆转录活性，那么RT-KTq2能够成为一款优秀的逆转录扩增酶。
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• ⑤抑制剂抗性突变体。从各种各样的样本中进行核酸检测，是PCR的一个重要应用领域。一般的流程是，先从样本中将核酸提取出来，再用DNA聚合酶进行PCR扩增，最后根据核酸电泳条带或者荧光信号等方式观察扩增结果。有时候，因为样本的稀有性等原因无法提取DNA，或者基于检测时效性和便利性的考虑，我们希望能够直接从样本中扩增靶标基因，比如血液、动植物组织、土壤。这些样本中的复杂组分可能对DNA聚合酶有很强的抑制作用，失败的扩增会造成假阴性的误判，这促使研究人员通过分子改造提高聚合酶的抑制剂耐受性。野生型Taq DNA聚合酶对血液、土壤等抑制剂的耐受性很差，N端删除大片段的耐受性有所提高，但仍然难以满足要求。Kermekchiev等（Kermekchiev, 2009）通过定点饱和扫描突变得到的Klentaq 10和Taq 22突变体，可以耐受25%的全血和15%的土壤提取物，E708残基可能发挥了重要作用。相比一般的定向进化手段，CSR技术为获得高抑制剂耐受性突变体提供了基础。Baar等（Baar, 2011）选择了与Taq DNa聚合酶序列同源性较高的八个物种的聚合酶为亲本，通过StEP技术获得8T嵌合体文库，以泥炭提取物、焦油、腐植酸等抑制剂为筛选压力，经过三轮CSR，得到了一个优秀突变体2D9。2D9是由四种不同的聚合酶混组的嵌合体，在多种抑制剂存在条件下，耐受性都有显著的提高，并且保真度与野生Taq基本一致。
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• （Baar C, 2011）不同抑制剂下2D9对野生型Taq的相对活力
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• 2014年，该团队（Arezi, 2014; Hogrefe, 2016）通过CSR得到一个新的全长Taq突变体Taq 2C2（G59W，V155I，L245M，L375V，E507K，E734G，F749I），对EDTA血耐受比例达到65%，对肝素血耐受达到25%，催化速率也比野生酶有所提高，可以作为直接血液核酸检测试剂盒的聚合酶。2016年，Schafer等以Taq-E507K为亲本，通过定向进化得到一个突变体Taq 15（A61T, K346E, S357C, E507K, I707M, F749I），该突变体对PCR buffer中的缓冲液、盐离子浓度具有极高的耐受性，可以很好的直接从葡萄、马铃薯叶片中扩增>1Kb的DNA片段，可用于植物叶片直扩PCR试剂盒的研发。
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• ⑥快速延伸突变体。Taq DNA聚合酶在72℃时延伸速率大约是60nt/s，但实际中一般以1kb/min的速率扩增，一般一个PCR扩增下来，需要1-2h的时间。对于大样本量的检测或者时间要求急迫的检测，人们希望能够更快的扩增。Taq 2C2突变体的催化效率大约是野生Taq的2倍，氨基酸突变E507K对这种增强作用有重要意义。在一些报道中，直接提高Taq DNA聚合酶Kcat的突变体不多，但一般增加了模板亲和力或容错能力的突变体，往往在较短时间内扩增长片段的能力也同样增强。
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• ⑦长片段扩增突变体。Taq DNA聚合酶在长片段扩增上，最卓越的成果是Klentaq1与Pfu混合酶（Barnes, 1994; U.S. Patent 5436149），可以扩增长达35kb的Lambda DNA片段，保真性也比Taq DNA聚合酶显著提高，但单独的Klentaq1持续合成能力是显著下降的（比Taq低10倍）。Ignatov等（US 11/658,610）将Tth DNA polymerase（该酶的扩增能力高于Taq，但区分对引物3’错配不敏感）的N端4-600多肽与Taq DNA polymerase的C端554-832多肽拼接成一个新的嵌合体酶Tth-Taq，嵌合体的扩增能力接近Tth，延伸能力比Taq酶显著提高。将具有DNA结合能力的ssDNA或dsDNA结合蛋白与Taq DNA聚合酶融合，也能提高酶的延伸能力，但真正意义上的长延伸突变体，还是Yamagami等（Yamagami, 2014）通过对E742和A743的扫描突变得到的。E742A和A743H两个突变体能够很好的从Lambda DNA上扩增15kb的长片段（条件：99℃ 5 s，66℃ 5 min，30个循环）。然而有趣的是，E742A/A743H双突变体的引物延伸能力比单突变强得多，但PCR效果却不如单突变体。凝胶迁移实验的结果表明双突变体与DNA产物有更强的结合能力（在电泳图上产生拖带），这可能不利于PCR起始阶段的扩增，导致PCR失败。我在融合Sso7d结构域与KOD DNA聚合酶时，也发现了类似的情况。有研究人员认为，Taq DNA聚合酶校正活性的缺失限制了其长片段扩增能力，因为随着目标产物长度的增加，延伸过程出错配的概率也就越高，阻挡了继续延伸，保真酶因为能切除错配，往往具有更强的持续延伸能力。这个解释符合事实，我认为长片段延伸突变体除了提高Taq DNA聚合酶的DNA亲和力，也可能增加了“容错”能力，实际上是降低了保真性，这类突变体的实际应用意义不太大，高保真聚合酶在这方面明显具更有优势。
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• ⑧RNA聚合活性突变体。对Taq DNA聚合酶底物谱的改变，是其分子改造的一个重要成果之一，除了前面介绍的增强Taq DNA聚合酶掺入ddNTP、dNTP标记物等非标准脱氧核糖核苷酸的突变体，还有些研究将Taq DNA聚合酶变成了Taq RNA聚合酶。Xia等（Xia, 2002）以Stoffel片段为模板，通过基于噬菌体展示的定向进化，将其RNA聚合活性提高103-104。
• Ong等（Ong J L, 2006）通过一种称为short-patch CSR的定向进化方法，得到一个突变体AA40（E602V，A608V，I614M，E615G）能够以与wt酶掺入dNTPs相同的催化效率掺入NTPs和dNTPs。
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• ⑨跨损伤扩增突变体。Taq DNA聚合酶的跨损伤突变体，大多是由使用CSR技术而闻名的Holliger实验室完成的。d'Abbadie等（d'Abbadie, 2007）以Taq、Tth、Tfl三种聚合酶为亲本，经StEP混组和三轮CSR筛选得到若干突变体，扩增47,000-60,000年前的洞熊DNA时，成功率比野生酶显著提高。Loakes等（Loakes, 2009）通过CSR得到一个突变体5D4，能过聚合疏水性碱基类似物，后来Millar等（2015）将5D4用于重亚硫酸盐测序，结果发现5D4能够很好的跨过DNA损伤。此外，Obeid等（Obeid, 2011）以KlenTaq为模板，通过定向进化得到两个突变体I614K和M747K，它们获得了增强的跨损伤扩增能力。Obeid等I614K和M747K组合在一起后，双突变体的跨损伤扩增能力修复能力比单突变体显著增强。不过，这些突变体跨损伤能力的增强，是以牺牲保真性或者正常DNA扩增效率为代价的，它们应用范围比较狭窄，商业化价值不是太大。
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• 通过结构域融合得到的突变体
• ⑩结构域融合突变体。一些来源于嗜热菌的的α-螺旋结构具有稳定DNA的作用，Pavlov等（Pavlov, 2002）将DNA拓扑异构酶V上一段重复的螺旋-发夹-螺旋结构融合到Taq DNA聚合酶的N端和C端，结果N端融合酶TopoTaq对Na+、K+、甜菜碱的耐受能力显著提高，并且耐热性也有很显著的增强。Davidson等（Davidson, 2003）将Taq DNA聚合酶的480-485残基替换为T3 DNA聚合酶的硫氧还蛋白结合域（TBD），结果融合体的合成能力提高了20-50倍，移码突变概率降低6-7倍。后来，Wang等（Wang, 2004）将来自Sulfolobus solfataricus的Sso7d双链DNA结合蛋白，融合在Taq和Stoffel片段的N端，结果发现S-Taq与S-Stoffel的持续合成能力比之前显著增强，融合蛋白与野生酶的Kcat基本一致，但Km比野生酶降低4-8倍，融合蛋白还增加了对盐离子的耐受性，令人兴奋的是融合蛋白还没有改变酶的耐热性和保真性。Sso7d的融合“红利”在家族B的Pfu DNA聚合酶上效果更明显，风靡市场的Phusion高保真聚合酶就是Pfu-sso7d。

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• （Wang Y, 2004）Taq，Stoffel和S-Stoffel的PCR效率比较。 以DNA（130 pg / ml）为模板，扩增子的大小显示在底部。 PCR程序为：95°C 20s； 94°C 5s，72°C 30s（A）或60s（B）或2min（C），20个循环； 72°C 7分钟。

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介绍了Taq DNA聚合酶的克隆、大肠杆菌表达及酶学特征研究。

[11] D'Aquila R T, Bechtel L J, Videler J A, et al. Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating[J]. Nucleic Acids Research, 1991, 19(13): 3749.

介绍了一种提高PCR产量和特异性的方法：将模板与PCR试剂预先加热到高于退火温度的温度，在热块上混合后再进行PCR。

[12] Holland P M, Abramson R D, Watson R, et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3'exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1991, 88(16): 7276-7280.

介绍了利用Taq DNA聚合酶5’-3’外切活性切除放射性标记探针5’端碱基，通过放射性信号变化检测DNA的方法，促进了探针法qPCR技术的发展。

[13] Barnes W M. The fidelity of Taq polymerase catalyzing PCR is improved by an N-terminal deletion[J]. Gene, 1992, 112(1): 29-35.

介绍了一个N端236aa缺失的Taq DNA聚合酶突变体KlenTaq，其保真性高于全长酶。

[14]Huang M M, Arnheim N, Goodman M F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR[J]. Nucleic acids research, 1992, 20(17): 4567-4573.

介绍了基于Taq DNA聚合酶检测SNP的原理：如果引物3’末端与模板不匹配，Taq DNA聚合酶扩增效率很低甚至无法扩增靶标基因。

[15] Lawyer F C, Stoffel S, Saiki R K, et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5'to 3'exonuclease activity[J]. Genome research, 1993, 2(4): 275-287.

介绍了Taq全长和N端删除片段∆289-Taq（Stoffel片段）的克隆表达及酶学性质研究，结果∆289-Taq的热稳定性、盐离子耐受性高于全长酶，但持续合成降低10倍。

[16] Hu G. DNA Polymerase-catalyzed addition of nontemplated extra nucleotides to the 3′ of a DNA fragment[J]. DNA and cell biology, 1993, 12(8): 763-770.

介绍8种来源于噬菌体、大肠杆菌、栖热菌、火球菌等生物的DNA聚合酶，无模板3'延伸的特点，指出末端延伸的碱基具有一定偏好性，与末端碱基种类有关。

[17] Sharkey D J, Scalice E R, Christy K G, et al. Antibodies as thermolabile switches: high temperature triggering for the polymerase chain reaction[J]. Bio/Technology, 1994, 12(5): 506-509.

介绍了几种高亲和力的抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体，37℃时能完全抑制Taq的活性，高温变性后又能够完全释放出Taq的活性。

[18] Scalice E R, Sharkey D J, Daiss J L. Monoclonal antibodies prepared against the DNA polymerase from Thermus aquaticus are potent inhibitors of enzyme activity[J]. Journal of immunological methods, 1994, 172(2): 147-163.

介绍了九种不同的针对Taq DNA聚合酶重组体的单克隆抗体与Taq的免疫学作用。

[19] Barnes W M. PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1994, 91(6): 2216-2220.

介绍了通过混合Klentaq1与低浓度的Pfu能够显著提高PCR延伸长度的现象。

[20] Barnes W M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension: U.S. Patent 5436149[P]. 1995-7-25.

介绍了一个N端缺失突变体Klentaq1与Pfu混合后PCR性能显著改善的现象。

[21] Merkens L S, Bryan S K, Moses R E. Inactivation of the 5′-3′ exonuclease of Thermus aquaticus DNA polymerase[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Structure and Expression, 1995, 1264(2): 243-248.

介绍了两个Taq DNA聚合酶全长酶突变体，通过对N端结构域氨基酸的替换，丧失了5'-3'外切活性，但它们的持续合成能力接近野生Taq酶，显著高于Klentaq。

[22] Kim Y, Eom S H, Wang J, et al. Crystal structure of Thermus aquaticus DNA polymerase[J]. Nature, 1995, 376(6541): 612.

介绍了Taq DNA聚合酶全长酶的晶体结构。

[23] Tabor S, Richardson C C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy-and dideoxyribonucleotides[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1995, 92(14): 6339-6343.

介绍了一个关键氨基酸的突变，显著提高了pol I和Taq掺入ddNTP的能力，这个碱基是pol I:F762、Taq:F667，对应位置T7 DNA聚合酶上的Y526。

[24] Reeve, M. A., & Fuller, C. W. A novel thermostable polymerase for DNA sequencing. Nature, 1995, 376(6543): 796–797.

介绍了F667Y突变显著提高了Taq DNA聚合酶（KF）的ddNTP掺入活性。

[25] Eom S H, Wang J, Steitz T A. Structure of Taq polymerase with DNA at the polymerase active site[J]. Nature, 1996, 382(6588): 278-281.

介绍了Taq DNA聚合酶与引物-模板复合物的晶体结构，比较了Taq KF与pol I KF的结构差异。

[26] Magnuson V L, Ally D S, Nylund S J, et al. Substrate nucleotide-determined non-templated addition of adenine by Taq DNA polymerase: implications for PCR-based genotyping and cloning[J]. BioTechniques, 1996, 21(4): 700-709.

介绍了Taq DNA聚合酶无模板3'延伸的概率与反向引物5’端碱基的种类有关，还与PCR程序有关。研究指出，在使用Taq DNA聚合酶进行等位基因分型和TA克隆时，根据3'端延伸特征调整引物设计是有利的。

[27] Cline J, Braman J C, Hogrefe H H. PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases[J]. Nucleic acids research, 1996, 24(18): 3546-3551.

介绍了Taq、Pfu、Vent等一些耐热型DNA聚合酶的保真性。

[28] Vander Horn P B, Davis M C, Cunniff J J, et al. Thermo Sequenase™ DNA polymerase and T. acidophilum pyrophosphatase: new thermostable enzymes for DNA sequencing[J]. BioTechniques, 1997, 22(4): 758-765.

介绍了嗜酸嗜热菌无机焦磷酸酶（TAP）与Klentaq(F667Y)配合，可以产生均匀条带强度的序列数据，从而可以进行更长、更准确的序列测定。

[29] Li Y, Korolev S, Waksman G. Crystal structures of open and closed forms of binary and ternary complexes of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I: structural basis for nucleotide incorporation[J]. The EMBO journal, 1998, 17(24): 7514-7525.

介绍了Klentaq1-DNA模板-ddNTP三元复合物的晶体结构。

[30] Li Y, Mitaxov V, Waksman G. Structure-based design of Taq DNA polymerases with improved properties of dideoxynucleotide incorporation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96(17): 9491-9496.

介绍了一个Klentaq1突变体R660D/F667Y，该突变体即显著增强了掺入ddNTP的活性，又增加了掺入ddNTP的均一性。

[31] Ghadessy F J, Ong J L, Holliger P. Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replication[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2001, 98(8): 4552-4557.

介绍了CSR技术在DNA聚合酶定向进化中的应用，作者通过CSR筛选得到两个Taq DNA聚合酶突变体T8（热稳性明显提高）和H15（肝素耐受性提高130倍以上）。CSR技术改变了热稳定DNA聚合酶的定向进化方式，意义重大。

[32] Ahmadian A, Gharizadeh B, O’Meara D, et al. Genotyping by apyrase-mediated allele-specific extension[J]. Nucleic acids research, 2001, 29(24): e121-e121.

介绍了通过腺苷三磷酸酶提高等位基因特异性延伸准确性的方法，3'端匹配时DNA合成速率快，可以正常掺入核苷酸，3'端错配时DNA合成缓慢，来不及延伸即被腺苷三磷酸酶降解。

[33] Pavlov A R, Belova G I, Kozyavkin S A, et al. Helix–hairpin–helix motifs confer salt resistance and processivity on chimeric DNA polymerases[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002, 99(21): 13510-13515.

介绍了HhH模体与Taq DNA聚合酶形成融合蛋白的性质，提高了热稳定性和盐离子耐受性。

[34]Xia G, Chen L, Sera T, et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002, 99(10): 6597-6602.

介绍了一个RNA聚合活性显著增强的Taq DNA聚合酶的突变体。

[35] Davidson J F, Fox R, Harris D D, et al. Insertion of the T3 DNA polymerase thioredoxin binding domain enhances the processivity and fidelity of Taq DNA polymerase[J]. Nucleic acids research, 2003, 31(16): 4702-4709.

介绍了一个将来源于T3 DNA聚合酶的硫氧还蛋白结合域插入Taq DNA聚合酶3’-5’外切结构域的突变体，显著提高了Taq酶的延伸能力并将降低了对DNA重复单元的移码突变率。

[36] Wang Y, Prosen D E, Mei L, et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro[J]. Nucleic acids research, 2004, 32(3): 1197-1207.

介绍了将一个双链DNA结合蛋白(sso7d)与DNA聚合酶融合后，显著改善酶延伸能力的现象。本文分别将sso7d融合在Taq DNA聚合酶(∆289)和Pfu DNA聚合酶的N端和C端，不但显著增强了酶的持续合成能力，还不影响聚合酶的保真性等催化性能。Pfu-S7后来被广泛应用于高保真PCR，它就是现在大名鼎鼎的Phusion DNA聚合酶。

[37] Kermekchiev M B, Tzekov A, Barnes W M. Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR[J]. Nucleic acids research, 2003, 31(21): 6139-6147.

介绍了一个Klentaq的冷敏感突变体Cs3AC，该突变体低温（37℃）时几乎没有聚合活性，高温（68℃）时保持正常聚合活性，可以实现DNA的热启动可扩增。

[38] Germer S, Higuchi R. Homogeneous allele-specific PCR in SNP genotyping[M]//Single Nucleotide Polymorphisms. Springer, Totowa, NJ, 2003: 197-214.

介绍了SNP检测的实时监测改进：将位点特异性PCR与（SYBR green I）qPCR结合。

[39] Sauter, K. B. M., Marx, A., Evolving thermostable reverse transcriptase activity in a DNA polymerase scaffold. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7633–7635.

介绍了一个具有RNA聚合酶活性的Klentaq突变体M1，可用于一步法RT-qPCR检测。

[40] Ong J L, Loakes D, Jaroslawski S, et al. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide[J]. Journal of molecular biology, 2006, 361(3): 537-550.

介绍了一个改变了底物谱的Taq DNA聚合酶突变体，该突变体能够以基本相同的催化效率掺入dNTP个NTP，是一个耐热DNA/RNA合成双活性聚合酶。

[41] Gloeckner C, Sauter K B M, Marx A. Evolving a thermostable DNA polymerase that amplifies from highly damaged templates[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2007, 46(17): 3115-3117.

介绍了一个KlenTaq突变体M747K，M747K增加了dNTP错误掺入和错配延伸的可能性。

[42] d'Abbadie M, Hofreiter M, Vaisman A, et al. Molecular breeding of polymerases for amplification of ancient DNA[J]. Nature biotechnology, 2007, 25(8): 939-943.

介绍了一个能绕过DNA损伤和引物3’错配错配的一组突变体，并将突变体混合酶用于古代DNA的扩增，成功率显著提高。

[43] Loakes D, Gallego J, Pinheiro V B, et al. Evolving a polymerase for hydrophobic base analogues[J]. Journal of the American Chemical Society, 2009, 131(41): 14827-14837.

介绍了一个能够掺入疏水性碱基类似物的突变体5D4，通过CSR改变了Taq DNA聚合酶的底物谱。

[44] Kermekchiev M B, Kirilova L I, Vail E E, et al. Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples[J]. Nucleic acids research, 2009, 37(5): e40-e40.

介绍了一个新的热启动Taq DNA聚合酶突变体Klentaq 10，除保持了冷敏感的特征外，还显著提高了荧光染料等抑制剂抗性，可用于热启动qPCR扩增。

[45] Gaudet M, Fara A G, Beritognolo I, et al. Allele-specific PCR in SNP genotyping[M]//Single Nucleotide Polymorphisms. Humana Press, Totowa, NJ, 2009: 415-424.

介绍了SNP检测中基于多位点扩增的单管反应法：使用两条上游引物（分别对应两种基因型）和一条下游引物，其中一条上游引物5’端加一段“尾巴”，并在等位基因第-1位设置一个额外的错配，这样3’末端不匹配的引物几乎完全不延伸，最后根据电泳条带的数目与位置即可准确判定基因型。

[46] Ignatov K, Kramarov V, Billingham S. Chimeric DNA polymerase: U.S. Patent Application 11/658,610[P]. 2009-8-20.

介绍了一个Tth DNA polymerase与Taq DNA polymerase的嵌合体酶，嵌合体集合了Tth与Taq的双重优势，延伸能力显著增强。这种嵌合体的方式也是酶分子改造的一种重要手段，不过它有一个前提，嵌合的亲本之间必须有较高的序列同源性。

[47] Guo J, Yu L, Turro N J, et al. An integrated system for DNA sequencing by synthesis using novel nucleotide analogues[J]. Accounts of chemical research, 2010, 43(4): 551-563.

介绍了基于3'端核苷酸可逆终止子（NRT）和可裂解的荧光双脱氧核苷酸（ddNTP）的DNA合成测序（SBS）用于第二代DNA测序的原理及潜力，为NGS高通量测序系统开发提供了参考。

[48] Leconte A M, Patel M P, Sass L E, et al. Directed Evolution of DNA Polymerases for Next-Generation Sequencing[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2010, 49(34): 5921-5924.

介绍了一个Taq DNA聚合酶突变体Taq197，显著增加了可逆性修饰dNTP的掺入活性，具有NGS测序酶应用潜力。

[49] Chen F, Gaucher E A, Leal N A, et al. Reconstructed evolutionary adaptive paths give polymerases accepting reversible terminators for sequencing and SNP detection[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, 107(5): 1948-1953.

介绍了两个Taq DNA聚合酶突变体，掺入dNTP-ONH2底物的活性显著增强，还能同时掺入ddNTP，其中L616A对底物谱变化具有重要影响。

[50] Kranaster R, Drum M, Engel N, et al. One-step RNA pathogen detection with reverse transcriptase activity of a mutated thermostable Thermus aquaticus DNA polymerase[J]. Biotechnology journal, 2010, 5(2): 224-231.

介绍了一个Taq DNA聚合酶突变体Taq M1，它具有与野生型酶相似的PCR敏感性和5’-3’核酸酶活性，同时也表现出逆转录酶的能力，可用于一步法RT-qPCR检测。

[51] Baar C, d’Abbadie M, Vaisman A, et al. Molecular breeding of polymerases for resistance to environmental inhibitors[J]. Nucleic acids research, 2011, 39(8): e51-e51.

介绍了一个通过CSR技术得到的抑制剂抗性Taq DNA聚合酶突变体2D9，将同源性较高的8种不同的聚合酶进行混组，通过CSR筛选得到2D9突变体，对腐植酸、土壤提取物、焦油等抑制剂均有较强的耐受性，可用于直扩PCR。

[52] Obeid S, Schnur A, Gloeckner C, et al. Learning from directed evolution: Thermus aquaticus DNA polymerase mutants with translesion synthesis activity[J]. ChemBioChem, 2011, 12(10): 1574-1580.

介绍了一个KlenTaq组合突变体，用于损伤性DNA检测的性能。作者将通过定向进化得到两个突变体I614K和M747K组合到一起，结果双重突变体在扩增有损伤的DNA时，扩增能力比单突变体显著提高。

[53] Blatter N, Bergen K, Nolte O, et al. Structure and Function of an RNA‐Reading Thermostable DNA Polymerase[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2013, 52(45): 11935-11939.

介绍了一个Taq DNA聚合酶突变体RT-KTq2，它是在Taq M1基础上进一步突变得到的，逆转录活性更高，qPCR灵敏性更高，在RNA病毒一步RT-qPCR检测中具有不错的效果。

[54] Chen C Y. DNA polymerases drive DNA sequencing-by-synthesis technologies: both past and present[J]. Frontiers in microbiology, 2014, 5: 305.

介绍了聚合酶的改造及发展对NGS技术的推动。

[55] Arezi B, McKinney N, Hansen C, et al. Compartmentalized self-replication under fast PCR cycling conditions yields Taq DNA polymerase mutants with increased DNA-binding affinity and blood resistance[J]. Frontiers in microbiology, 2014, 5: 408.

介绍了几个对全血耐受性极强的突变体，它们的催化速率比野生酶有所提高，表观解离常数降低35-90倍。研究还发现E507K能显著提高Taq在95℃下的半衰期

[56] Yamagami T, Ishino S, Kawarabayasi Y, et al. Mutant Taq DNA polymerases with improved elongation ability as a useful reagent for genetic engineering[J]. Frontiers in microbiology, 2014, 5: 461.

介绍了通过对两个氨基酸的替换能够显著提高Taq DNA聚合酶PCR延伸长度的研究。

[57] Millar D, Christova Y, Holliger P. A polymerase engineered for bisulfite sequencing[J]. Nucleic acids research, 2015, 43(22): e155-e155.

介绍了一个Taq DNA聚合酶突变体5D4，5D4是一种Taq DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶的嵌合体，能够绕过重亚硫酸盐处理DNA的dU碱基和未转化完全的中间体dhU6S，研究人员使用5D4/Taq混合酶扩增BS处理后的人基因DNA片段，扩增效果显著优于Taq DNA聚合酶。虽然5D4/Taq的保真性比野生Taq有所下降，但在测序深度的修正下，不影基因甲基化位点分析的准确性。

[58] Schafer W, McEwan P, Van Der Walt E, et al. Modified DNA polymerases for improved amplification: U.S. Patent 9,315,787[P]. 2016-4-19.

介绍了一个Taq DNA聚合酶突变体Taq 15，对高浓度缓冲液和盐离子的耐受性显著增强，用于植物叶片的直接扩增表现良好。

[59] Hogrefe H, Cayouette M, Fox J, et al. Thermostable type-A DNA polymerase mutants with increased polymerization rate and resistance to inhibitors: U.S. Patent 9,523,085[P]. 2016-12-20.

介绍了Taq 2C2突变体应用在qPCR中，在缩短延伸时间和全血抑制抗性方面的表现。

[60] Bourn W, Appel M, Rush G, et al. Modified type A DNA polymerases: U.S. Patent 10,457,968[P]. 2019-10-29.

KAPA公司的专利，介绍一些定向进化得到的Taq DNA聚合酶突变体，文中列举的突变体比较多，其中Taq D2在DNA结合能力、高盐离子（K+、Na+）浓度抗性、PCR延伸长度、苯酚抗性方面比野生Taq具有更好表现。