dxy logo
首页丁香园病例库全部版块
搜索
登录

miRNA研究策略及实验设计和实操作干货

发布于 2023-12-20 · 浏览 5322 · IP 陕西陕西
这个帖子发布于 1 年零 61 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
icon花匠是自己 推荐
img


1 背景知识介绍

microRNA(miRNA)是一种长约18-22个核苷酸的RNA分子中广泛存的一种非编码RNA(ncRNA),可通过多种途径调控基因的表达,在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序,疾病进程等方面都起到重要作用。目前研究比较清楚的miRNA的3条调控途径是:1,影响RNA转录活性;2,抑制成熟mRNA翻译;3, 影响DNA甲基化。miRNA具体介绍请参考GBhouse《一文浅析非编码RNA起源及功能》。

通俗的讲具有功能的miRNA是基因在RNA聚合酶Ⅱ(RNA pol Ⅱ)参与下转录形成Pri-miRNA(成百上千个核苷酸),经过两步切割。第一步切割反应在细胞核内进行,由Drosha/DGCR8复合物催化完成,其中Drosha为III型RNA切割酶,是核心催化组分,DGCR8双链RNA结合蛋白,负责招募pri-miRNA底物核内切割产生长度约60-70个碱基左右的Pre-miRNA,然后Pre-miRNA出核,在细胞质Dicer RNA酶完成第二步切割。第一步在核内的切割反应尤为重要,一方面去除冗长的无关序列,从上千碱基长度的pri-miRNA产生仅60-70个碱基的Pre-miRNA;另一方面,切割产生的3’端就是最终成熟miRNA的末端,对于miRNA的功能至关重要,因此要求切割位点非常精确。

img

(图1 miRNAs生物合成及功能示意图)

 2 miRNA基本研究策略

研究miRNA的基本思路,首先是确定研究某种表型中的miRNA,一般来源于测序或者他人文章。对于一个感兴趣的表型,为了后期发表一个过得去的文章(高于或等于二区),强烈建议从miRNAs测序开始,现在好文章几乎都是从测序数据出发,然后深入研究(如果要发文章务必说服导师,不然,做的再完美也不行,甚至遇到苛刻的审稿人,认为你的数据不可靠)。其次,明确miRNA在某种感兴趣的表型中靶基因,预测靶基因一般涉及到Targetscan, miRDB, PicTar等软件预测靶基因3’UTR与microRNA的结合位点。预测到的靶基因成千上万,因此,还需要查阅相关文献,进一步确定miRNA和靶基因的靶向关系,这样就能够极大程度的增加实验的成功概率。最后,就是实验验证miRNA和靶基因的靶向关系,一般来说这里主要包含两步,构建靶基因3’UTR与含有microRNA的结合位点的双荧光素酶报告系统重组质粒,接着就是转染检测荧光值确定靶向关系。

img

(图2 miRNA研究策略基本思路导图)

 3 miRNA研究实操(以小鼠miRNA155-5P靶向SPI1为例)

3.1 Targetscan miRNA靶基因预测

(a) 打开Targetscan(https://www.targetscan.org/vert_80/),输入已经确定的miRNA(miRNA155-5P,查询模式为miR-155-5P),选择好 “物种”,输入确定“miRNA”然后点击submit即可;

img

(图3 miRNA靶基因预测示意图)

(b)找到miRNA靶向的基因(这里有若干个靶基因,但是我们已经确定了基因,因此只需要找到该基因即可。如果不确定,可以根据预测结果选择感兴趣的基因进行类似操作即可。)

img

(图4 确定miRNA的靶向SPI1的靶向作用)

(c)进一步确定miRNA与靶基因3’UTR结合/识别情况,点击图4的 Sites in UTR即可得到图5。

img

(图5 miRNA与靶基因结合情况确定)

3.2 miRNA序列下载

这里我们使用NCBI进行下载(因为miBase经常缓冲太慢),首先将查询目录确定为“基因”,然后输入“miRNA编号”和“物种”点击“search”即可,设置如图6设置;

img

(图6 NCBI下载miRNA序列设置图)

然后找到“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”的下选项“NR_029565.1” 并点击即可,如图7所示;

img

(图7 miRNA查询设置)

接着在新的界面找到ncRNA,发现此处出现两个ncRNA,但我们需要的小鼠miRNA155-5p(解释一下miRNA5p和3p,分别表明从前体的5’端臂和3’端臂加工而成),因此我们选择点击第一个ncRNA(即可被高亮标记miRNA155-5p的序列),如图8所示;

img

(图8 miRNA序列确定)

当然NCBI也提供了其它网址关于miRNA155的下载链接,如图9所示,如果大家能够打得开的话,可以进行相关下载。

img

(图9 miRNA155其它相数据库链接)

 3.3 下载基因的3’UTR

在这里我们使用NCBI进行下载,首先将查询目录确定为“基因”,然后输入“基因名称”和“物种”点击“search”即可,设置如图10设置;

img

(图10 检索特定物种的相关基因设置)

然后,确定要分析的基因,如图11所示;

img

(图11 确定小鼠Spi1基因点击基因即可)

 接着,确定基因的5’UTR(从mRNA起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密码子,简而言之起始密码子AUG以前可作为预测的5’UTR序列)和 3’UTR(从编码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴(Poly-A)的末端,简而言之终止密码子以后序列可作为预测的3’UTR序列)区域,找到“Genomic regions, transcripts, and products”,根据图12设置,即可获得基因5’UTR、3’UTR、内含子、编码区相关信息;

img

(图12 查询基因的5’UTR、3’UTR、内含子、编码区相关信息设置)

最后确定基因的5’UTR、3’UTR、内含子、编码区相关信息,蓝色为5’UTR和3’UTR, 红色为CDS,绿色为内含子,如图13所示;

img

(图13 NCBI对基因的5’UTR、3’UTR、内含子、编码区标记)

备注:更多的建议使用miBase查询和下载成熟miRNA和pre-RNA/Pri-RNA序列

4 双荧光素酶报告基因验证miRNA的靶基因

4.1 构建miRNA双荧光素酶报告重组质粒

常见的质粒一般是pmir-GLO (图14)或psiCHECK2 (图15)用于构建基因3’UTR重组质粒,然后合成microRNA mimics或microRNA negativecontrol。具体重组质粒的构建,可参考GBhouse 推文《基因过表达(Overexpression)引物(primer)设计+质粒图谱详解》。

img

(图14  pmir-GLO质粒图谱)

img

(图15 psiCHECK2质粒图谱)

 

4.2 质粒和miRNA合成物的转染

将靶基因3’UTR的双荧光素酶报告基因重组质粒载体+microRNA mimics和3’UTR的双荧光素酶报告基因重组质粒载体+ microRNA negative control共转染工具细胞293T或Hela细胞。共转染细胞24-72h后(具体时间需要摸索),进行双荧光素酶检测,确定目的microRNA的靶基因。可见,如果miRNA和靶基因相互作用会影响萤火虫荧光数值,一般来说萤火虫荧光数值降低。有的时候还需要加入miRNA抑制剂,消除内源miRNA的影响,具体根据自身实验而定。

img

(图16 miRNA与靶基因结合后荧光示意图)

5 结束。 

 

(爱自己!!!做科研!!! 每文格言林语堂“明智的放弃胜过盲目的执着,去出吹风吧,能清醒的话,感冒也没关系。有结果的叫付出,没结果的叫代价。有希望的叫等待,没希望的是煎熬。​”如果有用,关注楼主GBhouse,点赞+讨论,攻击型人格请请请不要关注和阅读!!!)

最后编辑于 2023-12-20 · 浏览 5322

3 23 1

全部讨论0

默认最新
avatar
3
分享帖子
share-weibo分享到微博
share-weibo分享到微信
认证
返回顶部