肠道菌群研究，设计时应考虑哪些因素？

近年来，菌群研究领域迅速发展。解密生命早期的菌群至关重要，因为诸多能够塑造菌群的事件都发生在这一阶段，包括出生时的胎龄、分娩方式、喂养方式、辅食添加、抗生素的使用等。

然而，“新生儿肠道菌群是从何时开始定植的？”目前仍然是一个具有争议的话题。最近，几位科研人员强调，健康婴儿出生时并非都是无菌的，在处理微生物量较低的样本时，仍需特别谨慎。在临床环境下收集与子宫环境相关的样本时，需保持严格的无菌状态，以及不能使用基于NGS的技术来区分活细胞DNA、属于死亡生物体的DNA，和从血流中易位而来的DNA。

人的肠道在出生时是一个有氧环境，而成年人的肠道菌群以专性厌氧菌厚壁菌门和拟杆菌门为主。新生儿的前驱菌群由耐氧的肠杆菌科组成，这些菌群会在几天之内降低肠腔氧气水平，使肠腔变为厌氧环境，允许严格厌氧菌定植，以双歧杆菌、梭菌、拟杆菌为主。

近期，一项大型儿童队列研究探讨了肠道菌群的发展，这项研究收集了来自三个欧洲国家和三个美洲国家共903名儿童的12500个粪便样本。研究提出了菌群发展的三个不同阶段：发育阶段（3-14个月）、过渡阶段（15-30个月）和稳定阶段（≥31个月）。香农多样性指数在前两个阶段显著变化，仅在稳定阶段不变。该研究代表了一个很好的模型，说明了如何将儿童年龄与其他协变量因素相协调。

一、儿科医生进行菌群研究应遵循的7个黄金步骤

二、儿科医生在菌群研究中应考虑的问题

三、影响儿童肠道菌群组成的主要产前、围产期和产后因素

四、微生物组生态学本质上是动态的，应多久收集一次样品？

实际上，这在很大程度上取决于研究试图回答什么问题。如果对于胃肠道疾病，可以在第一天到第二天之间观察到显著变化（例如，在围术期、与活动期或病理缓解期相对应的情况），如果要研究其他因素，比如饮食对菌群的影响，则需要更长的观察时间。

另外，最好从同一位患者中收集多个样品，以便根据患者类型、所涉及的中心和统计能力实现更好地标准化。从同一个人收集的样本是否可以在分析之前进行汇总是另一个需要标准化的问题。

重要的一点是，采样和存储对健康儿童和患病受试儿童的菌群组成都有影响。目前最广泛接受的方案包括立即均质化，然后用干冰或液氮冷冻，-80°C储存。但这种方法并不是通用的，特别是对于大规模人群的粪便样品、偏远/农村地区收集粪便等情况。但对于是否必须立即冷冻样品以及在什么温度下冷冻目前仍存在争议。

短期储存条件对菌落结构和多样性的影响总体上很小，但冻融循环的次数似乎对微生物群落的组成有影响，因此强烈建议在开始时就等分样品。当然，也可以使用一些DNA稳定剂来延长样品的稳定性。

总而言之，菌群的不稳定性与许多混杂因素以及疾病之间的关联性表明，菌群可能存在多面性。与生命后期相比，婴幼儿期拥有更为明显的微生物区系，不同区系可能具有不同的表现形式。生命早期阶段，一个共同的特征是细菌的丰富性和多样性在生长过程中会增加。因此，儿科医生应该知道几种与年龄有关的菌群谱，并且还应意识到有必要通过仔细考虑上述干扰因素，在确定的月度范围内将个体分类。

“临床菌群研究专家”不仅是一项新工作，而且还代表了该领域创造能力的进步，参与该领域的临床菌群研究专家和儿科医生需加倍努力，所有这些研究经验必然可使我们更好地理解从出生到整个童年关键时期的菌群发育。要强调的最后一个考虑因素是，宏基因组学仍需要将标准化的方法和程序充分融合，从而对工作流程每一步的变异性和偏倚来源进行调查，并提高研究之间的可重复性和可比性。这是从关联研究转向因果关系调查并回答复杂问题的必要前提。

参考文献：

DragoL,et al.What Pediatricians Should Know Before Studying Gut Microbiota.J Clin Med. 2019 Aug 12;8(8). pii: E1206.