大肠杆菌感受态的制备

在实验室中为了实现基因传递常常通过制备感受态细胞，通过化学或电击手法处理使细胞的通透性变大，细胞膜的表面出现一些可修复孔洞，此时细胞处于最适摄取和容纳外源DNA的生理状态，便于外源基因或载体进入细胞中，最后通过细胞膜的流动性，修复孔洞使外源DNA留在活体细胞中。

常用的感受态：

DH5α(使用最频繁，无抗性)，

stbl3由DH5α改造而来，但转化效率更高，并且菌的生长更快，

M13和M15(表达蛋白，含有kan抗性，配合使用的质粒pQE系列),

BL21（表达蛋白，不含抗性，配合使用pET系列质粒），

JM109和JM110（非甲基化感受态细胞）

以上这些感受态我都做过，方法大同小异，下面以DH5α为例说明

CaCl₂法制备感受态的具体步骤：

(1) 提前准备好*头和离心管，置于-20℃预冷。提前配制 0.08 M MgCl₂ /0.02 M CaCl₂(作为加入低渗溶液前的缓冲溶液) 和 0.1 M CaCl₂  /10% (V/V)甘油低渗氯化钙溶液置于-20℃预冷 (使用前提前拿出，为保证制备效果，使用时溶液是冰水混合物为好) 。

(2) 将所要制备的大肠杆菌，划单菌落，挑出单菌落平行划抗性平板 (kan⁺,Tc⁺,Amp⁺,) 和不含抗生素的白板，培养8 h后，挑只在白板上生长的菌落，接种于10 mL的LB液体培养基中，37℃摇床培养至对数生长期，按1% (V/V) 的比例转接到200-300 mL的新配制的LB培养液中扩大培养，培养3 h左右 (对数生长中期，无法拿捏的可以测OD₆₀₀=1左右) 。

(3) 置于冰上预冷10 min，转入到50 mL离心管中，4℃，4000 rpm，离心10 min，倒掉上清，收集菌体，根据实际需求可重复离心将100 mL/150 mL的菌液收集到同一离心管上。

(4) 往离心管中加入2 mL0.08 M MgCl₂ /0.02 M CaCl2 感受态制备缓冲溶液重悬菌体，在加满至40 mL混匀，置于冰上放置25 min，然后4℃，4000 rpm，离心10 min，倒掉上清，收集菌体，重复此操作一次。

(5) 按约3:100 (V/V，同一离心上收集的菌液) 加入0.1 M CaCl₂/10% (V/V)甘油溶液，吸打混匀，分装于1.5 mL的EP管中，每一管分装60-80 μL，标记感受态的菌株名称和制备日期后，置于-80℃冰箱保存备用。本实验室常用此方法制备DH5α、BL21、M15等菌株的感受态。

注：制备操作必须在无菌环境中进行，因此每个步骤使用超净工作台后，都应该灭菌，直到下一次操作。