Prime editing：一种为CRISPR编辑增添精确性和灵活性的新技术

一、简介：

导致疾病的大多数遗传变异体难以有效纠正，且无过量副产物。Broad研究所的David Liu等人开发了一种新的基因编辑技术： prime editing。

这是一种通用和精确的基因组编辑方法，它使用一个催化受损的 cas9 融合到一个工程逆转录酶，直接将新的遗传信息写入到指定的 DNA 位点，用 prime editing guide RNA (pegrNA) 编程，既能指定靶位点又能编码所需的编辑，相关文章发在Nature。

该实验在人类细胞中进行了超过 175 次编辑，包括靶向插入、缺失和所有 12 种点突变，而不需要双链断裂或供体 DNA 模板。并且在人类细胞中应用 prime editing，以有效地纠正镰状细胞病（需要 HBB 颠换）和泰-萨克斯病（需要 HEXA 缺失，由机体内己糖脱氨酶A（hexosaminidase A）功能异常引起）的主要遗传原因，在 PRNP 中安装保护性颠换，并将各种标签和抗原决定簇精确地插入靶位点。四种人类细胞系和初级有丝分裂后小鼠皮质神经元支持具有不同效率的初级编辑。相比于同源导向修复，Prime 编辑提供了效率和产品纯度优势，与碱基编辑相比优势互补，与 cas9 核酸酶相比，脱靶编辑要低得多。

Prime editing 大幅扩展了基因组编辑的范围和能力，原则上可以纠正约 89% 的已知致病性人类遗传变异。

二、prime editing的结构基础和原理：

图示：pegRNA结构： 包含一个间隔序列、一个 sgRNA 支架和一个包含逆转录 (RT) 模板（紫色）的 3'伸，其中包含编辑的碱基 （红色）和引物结合位点（PBS，绿色）。引物结合位点与切口的靶 DNA 链杂交。RT 模板与缺口下游的 DNA 序列同源，但编码的编辑碱基除外。

图示：PE:pegRNA 复合物与靶 DNA 结合并切割含 PAM 的链。得到的 3 个末端与引物结合位点杂交，然后使用 pegRNA 的 RT 模板对含有所需编辑的新 DNA 进行逆转录。编辑的 3'-flap和未编辑的 5'-flap之间的平衡，细胞的5' flap切割和连接以及 DNA 修复导致稳定编辑的 DNA。

图示：prime editing在试管内的生物化学实验概述。检测 5-Cy5 标记的带刻痕和不带刻痕 dsDNA 底物。sgRNA、5 延伸的 pegRNA 或 3 延伸的 pegRNA 与 dCas9 或 Cas9 H840A 切口酶预复合，然后与 dsDNA 底物、Superscript III M-MLV RT 和 dNTP 结合。在通过变性尿素 PAGE 分离和通过 Cy5 荧光可视化之前，允许反应在 37 ℃ 下进行 1 小时。

大概原理：RNA引导，酶切割

注释：

1、prime editor：Cas9与逆转录酶的融合体

了减少引入细胞的元件，研究人员将M-MLV逆转录酶与Cas9 H840A切口酶相融合，形成prime editor（PE）

他们还发现方向很重要，将逆转录酶融合到Cas9切口酶的C端可以提高编辑效率，并将将这种复合物成为PE1；

之后，David Liu实验室创建并评估了19种带有RT突变的PE1变异体。这些变异体可提高活性，增强模板与位点的结合，提高持续合成能力或改善热稳定性。最后，他们将Cas9切口酶与M-MLV逆转录酶的五突变体相融合，将其称之为PE2。与PE1相比，PE2在不同位点的编辑效率平均高2.3到5.1倍。

2、pegRNA：多功能的向导RNA

prime editing的另一重要元件是向导RNA（pegRNA）。它既是向导RNA，又编码了逆转录的模板。与带切口的基因组DNA链互补的序列可以作为引物结合位点（PBS）。PBS序列与目标位点杂交，并作为逆转录的起始点。

3、PE3：解离错配的DNA

一旦prime editing在一条链上合成编辑物，那么一条链上的原始序列与另一条链上的编辑序列之间将存在错配。为了指导异源双链的解离以利于编辑，研究人员采用一种之前开发的策略。他们在未编辑的链上引入切口，让细胞利用编辑过的链作为模板来重新合成第二条链。

三、prime editing的优点：

1、不大受PAM序列的限制：

prime editor扩展了CRISPR基因组编辑的范围，因为它可以在靠近或远离PAM位点的位置进行编辑，而不大像其他方法那样受到PAM的限制。对于prime editing，PAM到编辑点的距离可以超过30 bp。

2、碱基编辑更精确（相对而言）：

之前开发的Base editor只能实现四种类型的碱基替换（C->T、G->A、A->G和T->C），而prime editing可实现所有12种可能的碱基替换。同时，它也更精确。例如，Base editor会编辑窗口内的所有C或A，而prime editor只编辑pegRNA指定的对象。如果你无法接受bystander编辑，建议选择prime editor。

不过，在某些情况下，传统的Base editor却是首选。比如，如果目标核苷酸在经典的碱基编辑窗口内，那么碱基编辑的效率更高，插入缺失更少。不过，如果核苷酸位置不佳，那么prime editing效率更高，因为它对PAM位点的依赖性较低。

3、副产物更少：

在双链断裂后往往采用同源介导修复（HDR）来实现精确的编辑。但是，Cas9切割的效率较高，而HDR的效率较低。这意味着大多数双链断裂都是通过非同源末端连接来修复的。因此，HDR的效率往往低于10%。相比之下，prime editing在HEK293T细胞中的编辑效率可达到20-50%。

四、期望：

作为一种新的基因组编辑方法，prime editing还需要更多的研究。作者在论文中指出，有必要在全基因组范围内研究其脱靶效应，鉴定prime editor对细胞的影响，并评估体外和体内导入策略。而且，基因编辑作为一种在分子层面操作的技术具有很多不确定性、准确性和中靶性，总之，要认识到该技术的两面性，合理运用！

附：带上质粒来源https://www.addgene.org/，可以查询！另外需要原文的可以在官网查询，楼主也可以分享！