溴己新治疗新型冠状病毒肺炎的潜在机制分析
新型冠状病毒可通过飞沫、密切接触、气溶胶等形式传播。人群普遍易感。发热、乏力、干咳是新型冠状病毒肺炎（COVID-19）常见的临床症状。根据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第六版）》，目前临床上推荐使用α-干扰素、洛匹那韦／利托那韦、利巴韦林和氯喹来进行抗病毒治疗[1]。溴己新目前只作为辅助治疗药物，用于对症治疗缓解患者的呼吸状况。我们通过文献研究和分子模拟发现溴己新可能存在之前从未被发掘的抗病毒潜力，结合溴己新的其他呼吸系统作用，我们建议将溴己新作为一线药物用于抗击新型冠状病毒的临床实践中。
在临床应用中，溴己新对慢性支气管炎、肺气肿、支气管扩张等慢性阻塞性肺疾病，有黏痰不易咳出者较适用。一般口服8mg/片，每天2-3次，虽然是比较安全的OTC药物，但仍对肠胃有较大刺激，胃溃疡患者禁用，需要在医生和药师指导下用药，现在我们没有证据证实溴己新可以预防新冠病毒感染，若无必要请勿擅自使用，本文已经向中国药学杂志投稿，版权解释权归属中国药学杂志。
//1．新型冠状病毒病原学特点//
2019-nCoV和严重急性呼吸综合征相关冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征相关冠状病毒（MERS-CoV）同属于冠状病毒科β属。研究显示2019-nCoV与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-sl-coVZC45）同源性超过85%[2]。2019-nCoV表面有包膜，颗粒呈圆形或椭形，直径60~140 nm[3]。冠状病毒膜表面包含刺突糖蛋白（S蛋白）、小包膜糖蛋白（E蛋白）、膜糖蛋白（M蛋白）[4]。其中S蛋白具有受体识别和膜融合的功能，决定病毒是否能入侵靶细胞[5]。
2019-nCoV同SARS-CoV、MERS-CoV一样都可引发人体呼吸道感染。SARS-CoV主要感染纤毛支气管上皮细胞和II型肺泡细胞，MERS-CoV主要感染未分化的支气管上皮细胞和II型肺泡细胞。两者感染细胞类型存在差异与感染通路不同相关。前者以血管紧张素转化酶2（Angiotensinconverting enzyme 2, ACE2）作为受体，后者以二肽基肽酶4（DPP4）作为受体为受体。Xintian Xu[6]等人的研究表明2019-nCoV可以ACE2为受体感染上皮细胞。II型肺泡细胞同时表达ACE2和TMPRSS2蛋白酶[7]，可能成为2019-nCoV的靶细胞。最新的一项单细胞测序研究更发现ACE2 在肺部中大多集中在一小部分II型肺泡细胞中，证实了II型肺泡细胞可能是2019-nCoV在肺部的主要入侵途径[8]。
2．新型冠状病毒主要依赖TMPRSS2蛋白酶进入细胞//
Peng Zhou[9]及Hoffmann[10]等人的研究阐明了可能的病毒感染通路：2019-nCoV同SARS-CoV一样，其S蛋白可以通过与ACE2结合吸附于宿主细胞膜表面，随后S蛋白在细胞丝氨酸蛋白酶(Transmembrane protease, serine 2, TMPRSS2)的作用下发生裂解，S蛋白裂解过程应可提供病毒外膜直接侵入细胞膜所需自由能(图2)。激活的S蛋白进一步启动病毒包膜与细胞膜的融合，将病毒遗传物质释放到细胞内进行复制，实现病毒入侵感染。研究表明TMPRSS2介导的感染通路是SARS-CoV主要传播和发病机制[25,26,27]，而且这一机制不会显著受到溶酶体途径抑制剂（E64d，氯喹）的影响[10]。TMPRSS2可显著提高多种冠状病毒进入靶细胞的数量。TMPRSS2共表达可将SARS-CoV感染增加10倍以上[13]，对MERS-CoV感染增加多达100倍[14]。最近Pöhlmann 实验室也发表了预印本证实SARS-CoV-2 也主要通过TMPRSS2蛋白酶的辅助通过ACE2受体进入靶细胞。TMPRSS2信使RNA主要表达在肺脏，肠道，肝脏，肾脏，睾丸等器官（图1），与2019-nCoV主要侵袭器官高度重合。Yu Zhao[8]等人最近的单细胞测序结果表明ACE2仅在肺部AT-Ⅱ细胞内高表达，表达量占全部肺部的83%。AT-Ⅱ细胞也同时高表达TMPRSS2，进一步证实了ACE2/ TMPRSS2共同作为病毒入侵肺部细胞的主要通路[8] (图2)。
在细胞缺乏TMPRSS2蛋白酶的情况下，SARS-CoV-2还可通过内吞的方式进入靶细胞[11]，病毒被内吞后在内吞体/溶酶体内酸性环境下通过溶酶体蛋白酶Cathepsin L与溶酶体发生膜融合，进而将遗传物质传递入细胞质内。但我们认为内吞/溶酶体途径只是新冠病毒感染的次要途径，只有在细胞不表达TMPRSS2而仅表达ACE2受体的情况下才会占主要作用，比如对健康肠道细胞进行的单细胞测序发现肠道各型细胞呈现ACE2与TMPRSS2分离表达的状态（未发布的单细胞测序数据），氯喹在这类TMPRSS2阴性细胞中可能会起主要的抗病毒作用(图2)。
此外，TMPRSS2还在宿主细胞高尔基体或质膜上对新病毒外壳蛋白进行剪切，对病毒成熟和释放起到关键作用[14]。除TMPRSS2外，SARS-CoV-S还可在FactorXa蛋白酶[12]的作用下启动S蛋白，但尚无Factor Xa蛋白酶对SARS-CoV-2的报道。
综上所述，我们建议在使用磷酸氯喹抑制病毒溶酶体途径的同时，应配伍TMPRSS2抑制剂溴己新来更有效的阻断肺部病毒感染。
//3．溴己新潜在抗病毒机制讨论//
从2019-nCoV潜在的感染入侵途径中不难看出，有效阻止病毒S蛋白与ACE2结合，抑制TMPRSS2的活性是治疗新型冠状病毒感染的有效手段。Lucas等人对三个化合物数据库（FDA、Chembridge library、Chem-Div library）进行搜索，寻找有效的TMPRSS2抑制剂。研究共发现了包括盐酸溴己新(bromhexine hydrochloride, BHH)在内的五种具有TMPRSS2抑制作用的化合物。对五种化合物半抑制浓度（IC50）进行比较，盐酸溴己新半数抑制浓度（0.75μmol / L）最小，说明盐酸溴己新是现有市售药物及临床前化合物中TMPRSS2的抑制剂最佳的选择[7]。另外，溴己新与其肝脏代谢产物氨溴索皆被报道可以穿透细胞膜，进入溶酶体等酸性囊泡并富集，通过酸碱中和反应及其对质子转运通道（氨溴索可直接抑制）的直接抑制中和降低囊泡中的酸性，这些机制与第六版治疗建议推荐的氯喹和其类似物羟氯喹（COVID-19治疗临床阶段）的作用机制非常类似。我们判断溴己新通过溶酶体中和机制产生的抗病毒效果也应与氯喹和羟氯喹相仿。另外氯喹在大鼠实验中被发现其肺部浓度比较血浆浓度富集200-700倍，溴己新及其代谢物氨溴索的pKa与氯喹相近，几种药物脂溶性(logP)都较高，可较为容易的穿透细胞膜并通过酸碱反应在酸性囊泡中富集，在临床上也发现溴己新和氨溴索可以在肺部快速大量富集(图3)。
新冠病毒靶向的Ⅱ型肺泡细胞（AT-Ⅱ）又称颗粒肺泡细胞，散在分布于AT-Ⅰ肺泡细胞（AT-Ⅰ）之间及其相邻的肺泡间隔结合处。其体积较小，呈立方形，表面稍突向肺泡腔。细胞核大而圆，胞质染色较浅淡，胞质中常见空泡称为肺泡二型细胞嗜锇性板层小体(osmilphilic multilamellar body，LB)。嗜锇性板层小体(LB) 外包薄膜，内富含磷脂（主要是二棕榈酰卵磷脂）、粘多糖、抗蛋白酶多肽，蛋白等，是人体内表面积最大的细胞酸性囊泡体系。溴己新（及其代谢产物氨溴索）可通过酸碱反应特异性的富集于LB中，进而升高其内部pH。溴己新代谢物氨溴索被证实还能特异性的影响溶酶体及LB脂膜结构，并中和pH从而引发LB内钙大量释放，促使LB通过胞吐过程与肺泡上皮表面融合，释放其内容物[15]；颗粒内物质释放出来后，会在肺泡表面形成一粘液层，称为肺泡表面活性物质（surfactant）。表面活性物质有降低肺泡表面张力，抗病毒，抗炎，稳定肺泡大小等作用。溴己新与氨溴索还可刺激内源性抗病毒多肽的产生和释放。溴己新及代谢物氨溴索具有抗氧化特性，可显著改善支气管粘液的流变性，并通过内源物质产生显著和持久的抗炎和抗病毒作用[16]。
新冠病毒感染患者临床初期常表现为无痰，干咳。患者中后期往往伴随缺氧及病情迅速恶化。病情发展初期，病毒入侵可能通过未知途径损伤二型细胞的分泌功能，导致痰液分泌减少，进而对病毒的阻滞作用降低，局部炎性物质排出减弱。在病情发展中期，肺组织受到损伤开始缺氧时，会使肺表面活性物质分泌进一步减少，此时进入肺泡的水肿液或纤维蛋白原可降低其表面活性物质的活力，引起肺内广泛的肺泡不张，血液流经这些萎陷肺泡的毛细血管时就不能进行气体交换，进而进一步恶化供氧[17]。这些病理表现都提示二型细胞功能受损，嗜锇性板层小体融合及其内容物释放不充分，可能是新冠肺炎患者血氧含量低的重要因素。临床使用溴己新可能通过刺激肺泡二型细胞分泌来达到维护肺部通气功能的作用，阻断缺氧导致的恶性病理循环。
另外，近期刘良教授等通过十多例新冠病毒死亡患者的尸检分析，发现死亡患者“气道又被黏液堵住，临床上会出现缺氧的表现。所以要改善人的缺氧状态，保持气道通畅，必须对黏液进行稀释或者溶解。溴己新通过增加溶酶体活性来降低痰液粘度，降低新冠病毒感染者肺部产生致命性黏液的可能性。在临床治疗上，如果黏液成分没有化解，单纯用正压给氧的时候可能会把黏液推得更深更广，会加重患者的缺氧。”在这种情况下，建议临床医生应先给病人使用溴己新/氨溴索进行化痰，吸痰以后，确保肺泡正常通气，再开始呼吸机高流氧操作。
鉴于危重病人肺部内细胞大量死亡，会通过细胞凋亡坏死过程释放出大量DNA，形成果冻状分泌液，导致患者最终窒息死亡。因为溴己新无法降解DNA，在危重患者中对溶解气管末端的果冻状痰液作用将会非常有限[24]。为防止这种情况出现，我们再次重申应尽早对将上呼吸机的患者首先使用溴己新进行化痰/吸痰操作，之后再使用高流速氧气进行救治。
//5. 溴己新及其代谢物氨溴索阻断ACE2/ SARS-Cov-2 S蛋白相互作用并且与SARS-Cov-2 M蛋白酶(Mpro)活性中心结合//
北京大学王月丹团队通过人工智能药靶筛选系统筛选，溴己新的体内代谢产物氨溴索从上市药物和上千种中药提取物中脱颖而出。研究发现氨溴索是潜在ACE2结合剂。其与细胞ACE2存在相互作用，可阻碍S蛋白与ACE2结合，进而阻断病毒吸附和入侵[18]。我们也重复了这项工作，通过SWISSDOCK分子模拟也发现溴己新与ACE2/S-蛋白结合面也有较强的相互作用（图4），可能与其体内代谢产物氨溴索同是潜在ACE2结合剂。双重机制都阻碍2019-nCoV的S蛋白受体识别和膜融合，从而阻断病毒入侵靶细胞。
我们也发现溴己新与SARS-Cov-2 M蛋白酶(Mpro)活性中心有较强的结合（图5）。Mpro 是SARS-Cov-2 病毒复制和成熟最关键的病毒来源蛋白酶，Mpro 抑制剂可有效的阻止SARS-Cov-2病毒复制机制，是抗新冠病毒制药研发的热点方向。通过计算机模拟发现的老药肉桂硫胺(Cinanserin)，在2005年被证实可以在体外强烈抑制SARS病毒的复制[22]，可达到EC50 5µM的病毒抑制率，计算化学对肉桂硫胺与SARS-Cov 的Mpro 的结合能Delta G 预测结果为-4.97 kCal/mol [23]（DeltaG数值负数为结合后可释放的自由能，负数绝对值越大结合越稳定）。而我们通过SWISSPORT计算的溴己新与SARS-Cov-2结合能Delta G数值为-8.55kCal/mol，超过了肉桂硫胺与SARS-Cov 的Mpro 的结合能预测。所以溴己新对SARS-Cov-2 Mpro的抑制率EC50有可能也在低µM范围，这方面值得进一步以体外生化实验及病毒实验验证。
6. 溴己新临床制剂和药物动力学特点//
溴己新上市剂型包括了片剂、注射剂、雾化剂等。2019-nCoV主要感染人体呼吸系统，针对这一特性雾化吸入溴己新可能会成为首选治疗方式。该方式可减少药物剂量，同时降低患者胃肠道不良反应的发生率。有研究表明在新型冠状病毒肺炎患者粪便中2019-nCoV核酸检测阳性[19]，提示2019-nCoV可能会通过消化道感染和传播。针对这种现象可考虑使用溴己新片。溴己新口服后1h见效，3～5h作用最强，可维持6～8h。绝大部分降解转化成代谢物随尿排出，仅极少数由粪便排出。
考虑到有效血药浓度维持、药物使用方便性，对于肺炎重症甚至昏迷患者可以考虑使用溴己新静脉滴注。溴己新可增强肺部细胞对于抗生素及其他药物的通透性和有效性，从而降低合用药物达到药效所需的剂量[20]，合用时应注意调整。
氨溴索是溴己新的肝脏代谢产物，但现有证据认为氨溴索不能抑制TMPRSS2，临床上应该首选溴己新，可以得到两个药的加成作用。另外溴己新葡萄糖注射液与多种药物存在配伍禁忌，在使用的过程中应当注意。包括：1）抗感染药物：阿莫西林克拉维酸钾、头孢米诺钠、注射用盐酸头孢替安美罗培南、注射用氨苄西林钠、注射用美洛西林钠舒巴坦钠、庆大霉素、磷霉素、奥硝唑氯化钠注射液2）抗病毒药物：阿昔洛韦、更昔洛韦钠3）激素类药物：地塞米松注射液4）利尿剂：呋塞米、托拉塞米[21]。
//7. 讨论//
新型冠状病毒除2019-nCoV-ACE2-TMPRSS2感染通路外是否还存在其他感染路径尚无定论。若存在其他感染机制，2019-nCoV-ACE2- TMPRSS2通路是否占据主导地位还有待于验证。溴己新作为长期使用的呼吸科常用药，不良反应非常罕见。潜在抗新型冠状病毒药物在使用过程中的安全性和有效性需要临床数据支持，但从已有报道和数据来看，溴己新因其多方面的潜在抗病毒作用，维持和恢复肺泡功能的功效，及其低毒性，可以作为一线抗病毒药物应用在抗击新冠肺炎的临床实践中（图6）。
此外，随着时间的推移（2-3天），溴己新可促进呼吸道分泌物中免疫球蛋白浓度显着增加，白蛋白和b-球蛋白浓度下降。增加的免疫球蛋白种类为IgA和IgG； IgM水平保持不变[24]。综上我们认为同时使用溴己新和抗生素合用将有助于控制新冠病毒感染导致的继发性细菌感染和局部炎症的控制。
最后值得注意的是，TMPRSS2还可诱导SARS S蛋白的部分降解。依赖TMPRSS2的SARS S脱落赋予病毒以抗性，可抵抗抗体的中和作用[13]。我们注意到临床报道不少患者在临床治愈之后，病毒核酸测试却阴转阳的病例，以及在咽部拭子阴性以后，患者粪便仍然产生阳性核酸检测的结果。结合TMPRSS2在肠道高表达的特征，我们认为SARS-CoV-S的S-蛋白在肠道细胞附近被TMPRSS2剪切之后，会丧失其免疫学特征，无法被已产生的抗体有效识别和中和。但部分病毒在TMPRSS2剪切之后可能仍可有效结合ACE2受体，导致病毒在肠道部位长期感染。另外肠道细胞附近因为经常需要处理外源性食物并接触肠道菌群，其免疫抑制比较强烈，同时高表达肝素等富含负电荷的糖蛋白（SARS-Cov病毒被证实可以与肝素结合[28]，我们推测SARS-Cov 也会与肝素有非特异性结合），这些都为病毒长期驻留提供了有利条件。所以我们建议，即使在患者临床治愈以后，仍然需要较长时间服用TMPRSS2抑制剂(溴己新)和其他抗病毒药物以预防产生无法被免疫中和的残余病毒。
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致谢：
在本文的写作中，中美健康峰会主席兼秘书长、四川省人民医院转化医学中心主任、哈佛大学医学院人群医学系马晶教授，四川省人民医院江华主任医师，南方医科大学儿童医院张玉霞教授，中国医科大学附属第一医院药学部初阳副主任药师，哈佛大学DanaFarber癌症研究中心李天霞博士，四川省人民医院转化医学中心副主任王轶博士，以及哈佛中美健康峰会智援小组各位成员，与我们进行了卓有成效的讨论和帮助，在此一并致谢。
基金项目：
国家临床重点专科建设项目(30305030698);四川省省级公益性科研院所基本科研业务专项课题(2018YSKY0017); 四川省人民医院院级科研基金临床研究及转化项目(2018LY09)
本文通讯作者王浩然仅代表其个人观点，截止投稿王浩然所在威海纽兰生物技术有限公司并无文中所述药物的销售与开发计划，本文写作与其公司并无利益冲突。
