3D打印PCL/GelMA复合的区域特异生化性能的仿生半月板

半月板是位于股骨和胫骨之间的半月形和楔形纤维软骨。半月板的外围主要呈现纤维状，含有大量的I型胶原蛋白（COL1）（占胶原蛋白总量的70–80％），而内部区域则为软骨状，含有大量II型胶原蛋白（COL 2）（胶原蛋白的50-60％）。这些胶原纤维主要沿圆周方向，有助于组织的拉伸性能。蛋白聚糖（AGG）在半月板的内侧区域含量更高，有助于组织的压缩特性。由于其复杂、特异性的结构，设计制造人工半月板是一项巨大的挑战。

现有的工程化制造半月板的尝试包括冻干泡沫、电纺垫，但是由于其较低机械性能并且可能导致透明软骨变性而无法真正投入临床应用。与此同时，随着生物3D打印概念的提出，越来越多的研究员开始使用聚己内酯（PCL）或海藻酸盐、胶原蛋白等水凝胶作为打印材料模拟天然结构打印半月板。为了模拟半月板的结构成分，Lee研究员团队在3D打印的PCL的内部和外部区域拴有转化生长因子和结缔组织生长因子的束缚微球。他们成功地设计了具有内部软骨和外层纤维的结构。然而，这种结构由于坚硬的PCL纤维易与较软的自然组织之间产生摩擦，从而使关节软骨退化。

为了解决当前无法准确制造人工半月板组织的问题，土耳其中东技术大学V. Hasirci教授团队开发改进了一种新型的半月板PCL支架（图1B）。该支架有以下特点：1）带有移位的纤维以降低结构的压缩模量，从而降低可能植入后软骨退化的风险。2）带有与天然半月板相似的周向环绕纤维，以增加拉伸性能。3）外部区域浸渍用细胞负载的甲基丙烯酸化明胶（GelMA），内部区域浸渍细胞负载的甲基丙烯酸化明胶（GelMA）-琼脂糖（Ag）来增强内外部的完整性和胶原的生成。根据实验的结果，该支架在结构和生化成分方面最接近于天然半月板，有望成为全半月板置换手术的替代物。相关论文“Anatomical meniscus construct with zone specific biochemicalcomposition and structural organization”近期发表于Biomaterials杂志上。

图1 研究内容概况

首先，研究人员将移位以及外围周向纤维对PCL支架力学性能的影响进行了测试（图1（i））。方形棱柱支架分为4组，对应于无移位无周向纤维NS，移位无周向纤维S，无移位有周向纤维NSC，移位有周向纤维SC（图2A）。在湿态下，支架表现出150-400KPa范围内的压缩模量和13-18MPa范围内的拉伸模量（图2B）。其中，移位和周向环绕纤维同时存在时（SC），由于其周向纤维与内部相邻的移位纤维的融合形成更为紧密和刚性的整体结构，从而得到最大压缩模量（380±40KPa）和最大拉伸模量（18.2±0.9MPa）。采用SC结构的半月板PCL支架（图2C）的压缩模量与拉伸模量均与天然半月板相当，表明了该仿生结构的力学性能满足要求。

图2 3D打印支架的设计及其对力学性能的影响

 随后研究人员测试了不同材料支架对细胞生长形态与基因表达的影响（图1（ii））。将纤维软骨细胞在PCL（S和SC型）支架和Ag、GelMA和GelMA-Ag水凝胶中各自培养7天（图3A）。根据实验结果，在PCL支架中，引入周向纤维诱导细胞沿周向生长并拉长，从而有助于增强组织的拉伸强度。另外纵向查看水凝胶中的细胞形态，GelMA和GelMA-Ag水凝胶中也具有较大的细胞长宽比。

不同的细胞-物质相互作用不仅影响细胞形态，也导致了不同基因的表达。根据实验结果，水凝胶中的细胞显示出比PCL（SC）支架更高的基因表达水平（图3D）。另外，GelMA显示COL1A1,COL2A1胶原蛋白的高表达，而GelMA-Ag显示COL2A1胶原蛋白和蛋白聚糖（AGG）的高表达。由此可以从中得出GelMA具有促进胶原纤维生成作用，含有Ag的GelMA-Ag水凝胶具有软骨生成性，促进AGG生成。

图3 细胞形态学与基因表达

 进一步地，研究人员将载细胞的PCL支架（SC型）浸入细胞负载的Ag、GelMA和GelMA-Ag水凝胶中通过交联固化得到PCL-Ag、PCL-GelMA和PCL-（GelMA-Ag）支架（图1（iii））。培养6周后，这4种支架细胞的生存率均约为80%，无显著区别。

图4 培养6周后的细胞存活率

 另外对4种支架培育6周后胶原蛋白COL1、COL2生成量分析表明COL1胶原蛋白的最高强度在PCL-GelMA上（图5E），在PCL中添加GelMA可以使COL 1沉积增加10倍。另一方面，COL2胶原蛋白在PCL-GelMA和PCL-（GelMA-Ag）支架上都表现出相似的高产量（图5F）。

图5 6周培养后支架上的胶原蛋白沉积情况

经过上述系列体外实验，发现GelMA诱导了纤维表型（在基因和蛋白质水平上I型胶原COL1的高表达），GelMA-Ag诱导了软骨表型（蛋白聚糖AGG表达和COL 2 / COL 1指数）。根据上述特性，研究人员将载纤维软骨细胞的半月板形PCL（SC）支架内外部分别浸渍载细胞的GelMA-Ag和GelMA得到双水凝胶-PCL构建体（图1B），并进一步在培养基中孵育4周（图6）。根据培育结果，构建体内、外部细胞活力高（图6C），内外区域COL1,COL2生化成分与自然半月板十分相近（内部为软骨状，外部为纤维状）。最后，利用小型猪膝关节的MRI数据成功打印了SC型PCL支架（图6E），这表明打印特定于病人半月板结构具有很大的可行性。

图6 类天然半月板生化成分、结构组织的人工半月板 

论文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961219304600