毕赤酵母电转化Pcr问题

实验流程:

1.将目的基因-ppicZaA进行线性化，切胶回收。活化GS115并用预冷的水和1M山梨醇制备感受态。

2.将酵母感受态放在预冷的电转杯中，加入线性化质粒以1500V 200Ω 25uF的参数进行电转化。

3.电转化后立刻加入1M山梨醇，然后30℃复苏2小时，随后涂布到含有100ug/ml博来霉素的YPD平板上。

4.于28℃培养，涂布100ul电转化后细胞平板约40小时后长出一巨大菌落。但稀释10、100倍进行涂布的平板没有长菌。

5、随后对未进行转化的Gs115及平板上大菌落进行反复冻融后PCR.引物为Aox1通用引物。得到结果如下图三。

疑点:

1.为何转化子那么少？大菌落是否杂菌？如果是杂菌，怎么能活着博来霉素抗性平板上？为何该菌落和Gs115空菌落形态有差距？

2.为何在显微镜十问下，重组子长的变得比较大且有芽痕，空菌较小。

3.PCR结果与理论不符合，没出现2.2kb条带与目的基因条带（目的基因大小约700bp）.（123为空菌落456为转化后长出的菌。）实验流程:

1.将目的基因-ppicZaA进行线性化，切胶回收。活化GS115并用预冷的水和1M山梨醇制备感受态。

2.将酵母感受态放在预冷的电转杯中，加入线性化质粒以1500V 200Ω 25uF的参数进行电转化。

3.电转化后立刻加入1M山梨醇，然后30℃复苏2小时，随后涂布到含有100ug/ml博来霉素的YPD平板上。

4.于28℃培养，涂布100ul电转化后细胞平板约40小时后长出一巨大菌落。但稀释10、100倍进行涂布的平板没有长菌。

5、随后对未进行转化的Gs115及平板上大菌落进行反复冻融后PCR.引物为Aox1通用引物。得到结果如下图三。

疑点:

1.为何转化子那么少？大菌落是否杂菌？如果是杂菌，怎么能活着博来霉素抗性平板上？为何该菌落和Gs115空菌落形态有差距？

2.为何在显微镜十问下，重组子长的变得比较大且有芽痕，空菌较小。

3.PCR结果与理论不符合，没出现2.2kb条带与目的基因条带（目的基因大小约700bp）.（123为空菌落456为转化后长出的菌。）