大鼠脑卒中模型伊文思蓝染色

大鼠MCAO手术堵塞2h后拔出栓线再灌注24h，处死前2h尾静脉注射2%生理盐水配置的伊文思蓝4ml/kg，因为大鼠尾静脉注射时虽然有固定架固定，但是挣扎的厉害，经常针头扎在尾静脉时突然猛的一缩，导致进针太过或偏了，所以是先用水合氯醛把大鼠麻醉后，再尾静脉注射的伊文思蓝，到时间够，用生理盐水灌注取脑，模型组有三只（行为学评分都符合模型组的评分）发现取出来的脑子基本上都像图2那样，没有染上伊文思蓝，，生理盐水灌注大鼠的大脑总有一片区域很暗淡，不明白什么原因。

图3是给药组，唯一一只染上了一点伊文思蓝的，但也有一片区域比较暗淡。

推测以下原因：

1.MCAO手术时，插栓线用力过了，导致颈总动脉深处出现了血栓，拔线后堵住了血流，导致伊文思蓝也没有流进去；（但总不可能模型组三只都这样吧？！）

2.伊文思蓝过期了，我买的是sigma的，销售说常温保存就可以，这次尾静脉注射用的是前个4，5天配置的，当时用完后，常温下放置了两三个小时，然后就一直放4摄氏度保存；（不至于过期吧，感觉伊文思蓝很稳定啊）

3.尾静脉注射前麻醉影响了伊文思蓝的吸收，导致了这种情况；（真有这种可能，实话说，我前一次做也出现了这种情况，我师兄看我尾静脉老打不进去，建议我先麻醉再尾静脉注射，前一次出现这种情况后，我师兄的解释就是第一条原因，我前一次插线也确实有点猛了）

4.尾静脉注射提前前2小时不够，伊文思蓝还没有结合和大脑血液中的白蛋白结合，所以染色不成功！？

5.真想不出来还有什么原因了，望各位做过伊文思蓝染色的前辈帮忙看看是什么原因，小弟先谢过了！谢谢