脑缺血动物模型介绍 「附：线栓法制备大鼠脑缺血模型（MCAO）的详细步骤」

脑缺血（cerebral ischemic）是指脑内血流不足以满足大脑正常代谢需求的病理生理状态。脑缺血常常会造成不同程度的脑损伤，因此被认为与神经退行性疾病相关。

临床上，脑缺血性疾病约占所有脑血管疾病的80%。具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点，是严重危害人类健康的疾病之一。由于临床研究的种种限制，为了更好地理解脑缺血的发病机制以及寻找有效治疗方法，自然需要相应的动物模型，以便开发相应的治疗手段。

今天，就来聊聊“脑缺血动物模型”。

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目前，已有多种实验动物被应用于制备脑缺血模型，包括啮齿类动物、非人灵长类动物、兔、猪等。由于大鼠脑血管解剖、神经元接近高等动物，重现性好，价格低廉，而且由于其脑组织小，便于冷冻后进行生化检测，因此，近些年来多用大鼠制备脑缺血的模型。

但是我们也要注意，不同亚型鼠，如Wistar大鼠、F344大鼠或SD大鼠，它们的脑血管解剖和缺血敏感性不同。

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对于缺血性动物模型而言，主要分为2类。即全脑缺血模型和局灶性脑缺血模型，血流是否恢复又分永久性闭塞和可再灌注。

全脑缺血模型，顾名思义即动物全脑血液供应阻断。目前，常用的全脑缺血模型有双血管闭塞/低压模型、四血管闭塞模型和三血管闭塞模型。

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局灶性缺血是指在脑内特定区域血流量降低，是人类脑缺血性疾病发作的常见类型。迄今为止，人们对局灶性脑缺血模型的研究较多，也更为深入。构建局灶性脑缺血模型方式有很多种，栓塞法、线栓法及光化学方法等。

大多数局灶性脑缺血模型都是阻断小动物或大动物某条主要脑血管，如大脑中动脉闭塞模型。大脑中动脉阻断，导致纹状体和大脑皮质脑血流量持续减少，但血流减少的程度和分布与阻断持续的时间、阻断部位及大脑中动脉供血区侧支血流的总量有关。

目前，脑缺血模型普遍采用国际上广泛认可的大脑中动脉栓塞模型（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO），其发病机理与人类缺血性脑卒中表现相似，对于制作模拟人脑缺血模型对脑缺血发病机制及药物筛选有重要意义。

该模型的经典方法为线栓法：分离暴露颈部血管，从颈外动脉( external carotid artery，ECA)或颈总动脉( common carotid artery，CCA)分叉处插入尼龙线，进入颈内动脉( internal carotid artery，ICA)，阻断大脑中动脉（Middle Cerebral Artery，MCA）起始端及其所有侧支血液供应，导致MCA区局灶缺血。

目前该模型具有代表性的线栓法有两类，即Longa法和Koizumi法。前者是把尼龙线头端烧成球形，后者在尼龙线远端涂一层硅酮弹性体（长度5 mm，直径0.25 mm），便于插入ICA并胀紧血管。

线栓法的优点在于模型制作无需开颅，创伤较小；操作相对简单，缺血部位相对固定，可控性好；可实现脑缺血后再灌注，是理想的标准局灶性脑缺血动物模型。缺点：结扎和手术需要一定的经验技巧。

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下面就以大鼠为例，详细介绍构建MCAO模型的构建：

一般采用雄性SD大鼠即可，手术成功率也比较高。（小鼠也是可行的，但是栓线的型号和进入的深度不同）

考虑大鼠雌激素水平对脑缺血损伤可能的神经保护机制及激素水平的生理性波动对大鼠情绪的影响，采用血管解剖结构更为清晰的雄性SD大鼠作为MCAO的动物模型。

大鼠大脑中动脉的长度和粗细与其体重形成正比，目前多主张大鼠体重控制在250-300g。

造模步骤：

（1）大鼠腹腔麻醉后，仰卧位固定，于手术台，常规备皮、消毒，手术全程保温。将小鼠门齿利用缝合线钩住、固定，使得颈部被拉伸，方便接下来的手术操作。

（2）利用常规眼科剪或手术刀从颈部正中切开，利用镊子钝性分离颈部腺体组织、筋膜，暴露并分离颈总动脉( CCA)、颈外动脉( ECA)和颈内动脉(ICA)。

（3）分离ICA及其颅外分支翼颚动脉，利用缝合线打活结，结扎翼颚动脉，或者直接利用血管夹夹闭翼鄂动脉，避免线栓插入翼鄂动脉，保持 CCA的唯一开放分支为ICA。

（4）分离ECA主干，结扎颈外动脉远心端和近心端(留长线头)，间隔5mm即可。从2个结扎点中间剪断动脉。然后轻轻牵拉近心端线头，使这截动脉与颈总动脉走形一致。

（5）使用微动脉夹夹闭颈总动脉和颈外动脉分叉的近心端，然后在颈外动脉的残留段上剪开一个小口，将提前准备好的栓线插入直至大脑中动脉的起始处，线栓插入17-18mm。

（6）结扎消毒后逐层缝合皮下组织和皮肤，等动物麻醉苏醒后放回笼中即可。等动物造模苏醒后出现明显偏瘫症状，身体倾斜，爬行旋转视为造模成功。

若要恢复大脑中动脉的血流，只需把线栓拔出，使头端退到颈外动脉，颈总动脉的血流就可以再灌注到大脑中动脉。

（7）对照手术模型的制作步骤同前，但血管分离后不插入线栓，结扎消毒后缝合皮下组织及皮肤即可。

还是没明白的话，可点击下面视频查看，视频里面对MCAO造模的两种方法和一些常见错误有详细的介绍。小编觉得最大的亮点是对血管结扎介绍得很清晰

以下视频来源于

中国针灸杂志

，时长

06:00

（来源：公众号中国针灸杂志）

注意事项：

（1）栓线的直径和线头是否光滑？

因为它直接关系到进线的难度和手术时间。栓线直径必须要考虑到动物的体重，不同体重的动物进线深度不同。所以保证动物体重基本一致，提前做预实验确定进线深度是非常有必要的。

（2）栓线不可过硬。

过硬线栓容易找手感，但是容易出现刺破蛛网膜下腔血管，导致颅内出血。同时过硬线栓还会改变血管自然形态，当线栓插入血管以后，因为线栓过硬，血管肌张力无法使得线栓改变形态，只能被线栓改变形态，导致血管处于紧绷状态，对于再灌注操作不利。

（3）栓线插入深度？

许多文献报道插入深度为18.5±0.5mm（270g左右大鼠），具体的长度需根据实验的实际操作进行调整，18.5mm并不是标准。总之，以遇到轻微的阻力为准，此时栓线正好进入颅内的大脑前动脉，阻塞大脑中动脉的开口。

建议当插线近18mm（做上标记）时，注意手的感觉，轻缓推进，直至感觉到阻力为止（当遇到阻力后，再插线会见到线弯曲）。

可能有人会说，把血管插破了也未感觉到阻力或线遇阻后的弯曲。一个原因是线太硬。另一主要原因是当栓线从血管切口插入后为防止血液从此处流出，需要结扎一条细线，这条线结扎的松紧程度很关键，应在不流血的情况下尽可能的松，这样你会发现进线时很轻松，一旦遇到阻力，就会感觉到。后者至关重要，请体会。

（4）不同亚型鼠，如Wistar大鼠、F344大鼠或SD大鼠，它们的脑血管解剖和缺血敏感性不同。同样的操作，Wistar大鼠脑梗死面积较小，F344大鼠脑梗死面积最大，SD大鼠居中。因此，正式试验前确定好大鼠种类也是比较重要的。

（5）血糖浓度高或低均可加重脑损伤，增加梗死面积，加重脑水肿，增大梗死后出血率。因此有必要监测和报告血糖指标。实验前12h～24h动物禁食是防止血糖升高的有效手段。

（6）最好能够实时观测颅脑血流情况。这样可以准确判断线栓是否阻塞 MCA，一旦血流灌注量下降超过70%，即代表线栓阻塞MCA。

模型评估

（1）神经行为学评分：缺血24h后进行评分。

Longa评分法：

① 无神经功能缺陷：0分；

②瘫痪侧前爪不能完全伸展：1分；

③行走时向瘫痪侧转圈：2分；

④行走时向瘫痪侧倾倒：3分；

⑤不能自动行走，存在意识丧失现象：4分。

分值越高，说明动物行为障碍越严重。模型大鼠成功构建的标准：大鼠出现症状如偏瘫，对侧前肢下垂和站立不稳。

Bederson评分法：

抓起动物的尾巴，使动物离台面10cm高。此时，正常大鼠的前爪处于伸直状态，而存在神经功能病变的动物则可出现如下表现：

① 无神经功能缺陷：0分；

②动物尾巴提起后，瘫痪侧前肢回收并屈于腹下，而正常侧肢体伸向台面：1分；

③除第二条表现以外，俯卧于台面时向瘫痪侧侧推动物的阻力较正常侧明显降低：2分；

④除第一条和第二条以外，动物行走时向瘫痪侧旋转：3分。

Bederson评分在1-3分，48小时内没有死亡，就认为模型成功。文献上用的是2-3分的模型。

（2）缺血脑组织染色（TTC 染色）

迅速将大鼠大脑取出，用冷盐水冲洗后，快速放于-20℃冰箱中放置10分钟，待脑组织稍硬后，取出切掉嗅球、垂体、低位脑干，由前向后冠状切片，均匀切成2 mm厚脑片，等分切成5片，置于1%TTC溶液中，37℃避光孵育30分钟，每隔5分钟左右翻动一次。TTC可与正常组织内的脱氢酶系统反应被还原为玫瑰红色，因此使组正常组织染呈玫瑰红色，梗死组织呈白色。

（3）病理形态学观察

假手术组神经细胞、胶质细胞及毛细血管形态正常，结构完整，核仁清晰，胞浆无红染。模型组，神经细胞大片消失，坏死区边缘可见神经细胞变性，缺血周围区锥体细胞明显减少，胞体变小，尼氏小体消失，核固缩深染；星形细胞和小胶质细胞增生，星形细胞肿胀。

参考文献：

[1].Current advances in ischemic stroke research and therapies ( https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2018.09.012)

[2]. 脑缺血动物模型的制备及评估进展（DOI:10.12300/j.issn.1674-5817.2021.085）