大鼠尾椎间盘退变模型（针刺+OVX）

大鼠尾椎间盘退变模型（针刺+OVX）

一、动物模型构建

1、实验动物

选取 3 月龄雌性 SD 大鼠（300±18 g）[1,2]。3 月龄大鼠骨骼成熟，生长对诱导椎间盘退变的干扰可能较小[5]。

近端的尾椎间盘更适合作为退行性变模型，因为大鼠尾部发育过程中存在头尾成熟度梯度，近端椎体比远端椎体更成熟，3 月龄时远端尾椎骨仍有生长[5]。

2、麻醉

10% 水合氯醛（chloralhydrate，350 mg/kg）[1]或戊巴比妥钠（sodium pentobarbital，30 mg/kg[2] 或 40mg/kg[6]）腹腔注射，全身麻醉。

为控制术后疼痛，苏醒前使用丁丙诺啡（buprenorphine，0.01 mg/kg）1次，根据需要再使用。盐酸阿替帕唑（atipamezole hydrochloride，0.2 mg/kg）逆转麻醉[1]。

3、鼠尾间盘针刺（puncture）

仰卧位，图像引导下，20G[1] 或 21G[2,4] 或 18G [3,6] 针经皮穿刺尾椎间盘（Co5/6、Co6/7、Co7/8），插入深度约 3mm[2,4] 或 4mm[6] 或 5mm[3] 以到达髓核中心，针头旋转 360° 并保持 30s[2,3,6] 或 10s[4]。使用定制的针头塞以精确控制插入深度并在旋转过程中稳定针头[3,6]（图中为Co6/7[6]，经实验证实该描述错误，约为Co7/8）。

• 若无图像引导，可切开相应位置皮肤至深筋膜，定位后针刺[2]。针头规格见帖：穿刺针型号（G）。
• 可注入无水乙醇 40 μL 进行造模[6]。

4、双侧卵巢切除（ovariectomy，OVX）

侧卧位，备皮并碘伏消毒，肋骨下行 1 cm 切口。打开各层组织，显露卵巢。于卵巢根部结扎后切除，缝合切口。另一侧卵巢以相同方法切除[2]。

二、椎间盘退变评估

1、MRI

• 全身麻醉，2%异氟醚（2L/min氧流量）维持麻醉[1,2]，以避免肌肉收缩引起的椎间盘高度误差[1]。检查下肢肌张力，肌张力消失表示肌肉松弛[1]。
• 伸直大鼠尾巴，获取鼠尾 T2WI 矢状位图像。根据 Pfirrmann 分级进行评估[2]。

有学者[3]使用基于 Pfirrmann 分级的 4 级评价系统评价鼠尾间盘：1 级代表正常椎间盘（高信号、椎间盘高度正常），4 级代表严重退变（低信号、椎间盘高度降低或塌陷）。

联合造模的大鼠尾椎间盘退变程度更高，术后 4 周即可出现 MRI 可检测到的椎间盘退变。随时间延长，椎间盘退变程度更加严重[2]。

2、组织学

• 影像学检查后处死，取穿刺节段椎间盘及相邻椎体。
• 固定，脱钙，脱水透明，石蜡包埋。平行于针刺方向连续正中矢状面切片 4um[2] 或 5um[1,4]。
• HE染色、Safranin-O染色[2]。

三、雌激素的椎间盘保护作用

双侧卵巢切除联合鼠尾间盘穿刺（OVX+Puncture），术后皮下注射雌激素（25ug/kg[1] 或 10ug/kg[2,4]），对照组注射玉米油（玉米油作为雌激素溶剂）。

1、评估[2]

术后 12 周行 MRI、HE染色、Safranin-O染色，证实外源性雌激素的补充有效缓解了椎间盘退变程度[2]。

2、X线

• 全身麻醉同 MRI。伸直大鼠尾巴，拍摄大鼠尾椎正侧位，于正位片测量椎间盘高度指数（DHI）[1]。

Liu[1]在术后 4 周行 X 线检查，并增加了雌激素受体拮抗剂（ICI 182780）组以验证雌激素是否通过雌激素受体发挥作用。结果表明，联合造模（OVX+Puncture）后，椎间盘高度明显下降，补充外源性雌激素可以通过雌激素受体发挥对椎间盘的保护作用[1]。

图中 Sham 为单纯鼠尾间盘穿刺，OVX 为联合造模，E2 为联合造模后补充雌激素（25 ug/kg），ICI 为联合造模后补充雌激素（25 ug/kg）及雌激素受体拮抗剂（ICI 182780，25 ug/kg）[1]。

3、组织学检测

Liu[1]在 X 线检查后处死大鼠，操作同前。切片后进行 HE染色以及IHC、WB、qRT-PCR（检测 caspase-3、MMP-3、MMP-13）[1]。

（1）HE染色

联合造模（图中 OVX）后，观察到椎间盘组织退变：正常细胞百分比明显下降；细胞形态不规则，部分细胞肿胀；细胞核外染色质层向中心聚集，分布不均匀，部分细胞呈粉红色，无细胞核（Figure 3）。外源性雌激素补充可以缓解椎间盘退变[1]。

（2）蛋白表达

联合造模后，椎间盘组织的 caspase-3、MMP-3、MMP-13 在蛋白水平和转录水平均表达增加，而 collagen Type II 在蛋白水平和转录水平表达降低。外源性雌激素补充可以缓解以上改变[1]。

IHC 发现，联合造模（图中 OVX）后，在NP细胞旁区以及NP/AF边界，特异性降解ECM的MMP-3、MMP-13呈强阳性表达，而ECM的主要成分collagen Type II表达减弱，caspase-3表达明显。外源性雌激素补充后，MMP-3、MMP-13阳性染色明显减弱，collagen Type II表达增强，caspase-3几乎无表达（Figure 7）[1]。

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参考文献

[1]Liu S, Yang SD, Huo XW, Yang DL, Ma L, Ding WY. 17β-Estradiol inhibits intervertebral disc degeneration by down-regulating MMP-3 and MMP-13 and up-regulating type II collagen in a rat model. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2018;46(sup2):182-191. doi: 10.1080/21691401.2018.1453826. Epub 2018 Jul 29. PMID: 30056756.

[2]Tian T, Wang H, Li Z, Yang S, Ding W. Intervertebral Disc Degeneration Induced by Needle Puncture and Ovariectomy: A Rat Coccygeal Model. Biomed Res Int. 2021 May 17;2021:5510124. doi: 10.1155/2021/5510124. PMID: 34055972; PMCID: PMC8147532.

[3]Inoue H, Montgomery SR, Aghdasi B, Kaner T, Tan Y, Tian H, Terrell R, Wang JC, Daubs MD. The effect of bone morphogenetic protein-2 injection at different time points on intervertebral disk degeneration in a rat tail model. J Spinal Disord Tech. 2015 Feb;28(1):E35-44. doi: 10.1097/BSD.0000000000000141. PMID: 25089674.

[4]Wang H, Li Z, Huo Y, Tian T, Yang D, Ma L, Yang S, Ding W. 17β-Estradiol alleviates intervertebral disc degeneration by inhibiting NF-κB signal pathway. Life Sci. 2021 Nov 1;284:119874. doi: 10.1016/j.lfs.2021.119874. Epub 2021 Aug 11. PMID: 34390725.

[5]Han B, Zhu K, Li FC, Xiao YX, Feng J, Shi ZL, Lin M, Wang J, Chen QX. A simple disc degeneration model induced by percutaneous needle puncture in the rat tail. Spine (Phila Pa 1976). 2008 Aug 15;33(18):1925-34. doi: 10.1097/BRS.0b013e31817c64a9. PMID: 18708924.

[6]黄帆,邸安琪,丘明旺等.X射线引导建立大鼠椎间盘退变模型[J].中国组织工程研究,2022,26(35):5652-5657.