Nrf2跑不出来，求各位战友支招

各位前辈，请教一件事

我跑nrf2总蛋白已经两个多月了，但是跑不出来想要的，很崩溃！

刚开始的时候在70左右的位置跑出来了，之后再也没出来 如下图1

图1: 注：左右两边是marker的显色70的位置

第一批组织跑了几次都是如上图，之后裂了新的组织就再也没有出来了，一开始怀疑抗体坏了，就重新配，但是都没有，紧接着我就用膜覆盖了整个胶，爆出来蛋白在40左右（抗体是origine的），如图2

然后我就换了一个abcam的抗体，也是先整块敷了一次 如图3

图三：注：从上到下依次是40左右 70左右 110左右

我看着似乎110可以用，说明书也说的是110是目标位置，所以接下来就切55-130的位置，但是又变成空白或者很淡很淡的一条。

我操作流程如下

1我裂解用的是RIPA+PMSF+蛋白磷酸酶抑制剂

2胶是自己配的10% 10孔

3上样蛋白量是30ug 每孔15ul 

4 转膜300ma 60/65/70/75/80/85/90分钟都试过了

5.牛奶封闭1.5h

6一抗origine和abcam不同浓度都试过了 如上图

7组织是-80度冻存数月的大鼠海马组织，新鲜组织也用过，情况无转变

8每次条带上其他的蛋白都是很好看的，内参也是秒爆出来而且背景很干净，很整齐

恳请帮我支支招！已经崩溃不行了。。。