【LC3跑WB方法】

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在进行自噬研究时，提取蛋白进行Western Blot 实验，检测LC3-I 和LC3-II 几乎是必做的实验，那么，进行LC3 检测时，需要注意哪些要点呢？我们一一道来。

LC3: 从何处来？往何处去？

LC3/Atg8 被具有蛋白内切酶活性的Atg4 在羧基端剪切，生成胞质LC3-I。LC3-I 通过Atg7 和Atg3（分别对应E1 和E2 样酶）参与的泛素样反应，使磷脂酰乙醇胺（PtdEth，PE）偶联，生成脂质化形式的LC3，也称作LC3-II，它可以附着到自噬体（autophagosome）的膜上，是自噬体的结构蛋白。在降解过程中，位于自噬溶酶体外膜的LC3-II 被半胱氨酸蛋白酶Atg4B 移除后回收，位于内膜的LC3-II 则与包裹的内容物一起，被溶酶体降解。

图1：自噬信号通路的调控

LC3A/B/C 有种属细胞/组织分布特点

哺乳动物LC3 蛋白的四个亚型（LC3A，LC3B，LC3B2 和LC3C），他们的表达因组织或细胞类型而异。如图2 所示，在甲状腺（Thyroid，第一行）中，LC3B 的表达水平并不高，检测LC3A 更为合适。所以，需要根据自己使用的细胞系或者组织的情况，使用合适的靶标抗体。当然，通过使用抗LC3A/B 抗体，同时检测LC3A 和LC3B，可以大大增加实验的成功率。

图2：小鼠组织/ 部分细胞中LC3A 和LC3B 的mRNA 水平差异（来源：Biogps）

LC3 的来去是一个动态过程

正如前言所述，LC3-I 和II 存在一个生成-降解的动态过程。自噬小体有一个生成、融合、降解的过程，即「自噬流」。所以，单时间点LC3-II 的表达改变并不能体现自噬的改变，需要使用一些阻断溶酶体降解的药物（如氯喹、巴佛洛霉素A1 等），判断在干预手段下，细胞的自噬程度的改变。氯喹可以通过抑制溶酶体功能（比如升高它的pH 值），抑制LC3-II 的降解；巴佛洛霉素A1 则是一种强效V-ATPase 抑制剂，阻断溶酶体依赖的降解。在「堵漏」的前提下，根据一段时间内LC3-II 的积聚程度，判断自噬的改变（图3）。

图3：干预条件下，LC3 印记结果示例（摘自文献3）

a 组，LC3-II 在a 处理下表达升高，使用Baf A1 后，进一步升高，提示自噬流的升高；

b 组，LC3-II 在b 处理下表达无明显变化，且使用Baf A1 后无明显积聚，提示自噬流的降低；

c 组，LC3-II 在c 处理下表达升高，使用Baf A1 后未见明显积聚，提示自噬被抑制。

LC3 检测的注意点

目前的LC3 抗体所检测的抗原表位都位于LC3 的N 端，由于PE 基团结合可能导致N 端区域的构象变化，使得抗体对LC3-II 的亲和性更高，所以LC3-II 条带显色深并不能代表该样本处于高自噬状态。另外，LC3-I 对反复冻融更为敏感，也更易在SDS 上样缓冲液中降解。基于以上两个原因，在半定量时，除了使用LC3-II/LC3-I 的比值外，也有科学家使用LC3-II 与管家蛋白（Housekeeping Protein）的比值进行半定量。

LC3 是一个膜相关蛋白

作为脂化和膜相关蛋白，在细胞裂解后，对其进行冰上短暂超声，促进蛋白的溶解，将LC3 从膜上解离。

超声方法：使用35%~40% 的最大功率进行3 次超声脉冲，每次超声时间10 秒，每次超声之间停顿10 秒，不同的仪器可以调整最大功率水平在200 W 左右。

如没有细胞超声仪，可使用1 mL 注射器（带针头），通过反复抽吸的方式达到类似于超声的效果。

LC3-I 和LC3-II 是小分子蛋白

LC3-I 的分子量约16 KD，由于LC3-II 接合了PE 基团，所以理论上，LC3-II 的分子量比LC3-I 更高。但是，由于带负电的PE 改变了LC-II 的性质，使其疏水性更强，导致其在电泳中迁移率更高，所以，LC3-II 在电泳后，停留在了更小分子量（约14 KD）处。

小分子量、LC3-I 与LC3-II 仅有2 KD 差异，在WB 中需注意：

• 使用高浓度分离胶（~15%，确认Tris 缓冲液的pH 值）进行分离；

• 转膜时，使用小孔径0.22 μm 转印膜，湿转70 V、1.5 h 即可。对于半干转（如Trans-Blot Turbo System），则可使用2.5 A、7 min。

今年10 月，CST 技术人员赴重庆某医院实验室演示了Western blot 的操作方法，现场进行了LC3 检测，得到实验结果如图4 所示，LC3-I 和LC3-II 条带清晰。

图4：使用经过氯喹（CQ）处理的Hela 细胞蛋白裂解物（LC3 Control Cell Extracts #11972，为阳性对照），LC3A/B 抗体（12741#）进行检测

自噬是一个「流动」的过程，目前，检测自噬流的方法有很多，除了Western blot 外，还有电镜、长寿命蛋白降解实验，mRFP-GFP-LC3 双荧光系统等等，每一种实验方法都有其优缺点，所以，需根据实验目的选择合适的实验方法，或者使用多个独立的实验方法进行交叉论证，才能得到可靠的结论。

【参考文献】：

1. Vojo Deretic, Autophagosome and Phagosome, Humana Press

2. Daniel J Klionsky, et al, Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition), Autophagy, 2015

3. Saori R. Yoshii, Monitoring and Measuring Autophagy, International Journal of Molecular Sciences, 2017

4. Noboru Mizushima, How to Interpret LC3 Immunoblotting, Autophagy, 2007

5. Sandra Barth, et al, Autophagy: assays and artifacts, Journal of Pathology, 2010