关于人PBMC分离后单核细胞不贴壁的问题

小弟最近计打算做树突状细胞与T淋巴细胞共培养的实验，目前在做人PBMC分离后诱导树突状细胞，人外周血2ml用国产的淋巴细胞分离液450g离心22min后，云雾状的白膜层还是比较明显的，但目前遇到单核细胞不贴壁的问题，特向各位前辈们请教。

1.吸取白膜层后，用5ML PBS重悬2000rpm/10min×1次；5mlPBS 1000rpm/10min×1次；5ml 1640

1000rpm/10min×1次，但种到25cm·2培养瓶（4ml血分离出的PBMC）镜下看还是有很多“小黑点”，参考之前的帖子，小黑点应该是血小板，但为什么祛除效果不好呢？减少稀释液重悬的体积、增加离心次数会有帮助吗？

2.单核细胞不贴壁的问题：别的帖子的老师建议使用无血清的培养基，贴壁效果会好一点。楼主用无血清培养基试了一次，贴壁6小时后，细胞确实是贴在培养瓶上的，轻轻摇晃后用预热的1640培养基润洗2遍，当时看细胞绝大部分是贴在培养瓶上的，更换为含10%FBS（Giblo公司）的1640完全培养基并加入rhIL-4、rhGM-CSF，但第二天看细胞就又有一部分悬浮起来了，而且悬浮的细胞有越来越多的趋势。（摇晃培养瓶，细胞也跟着轻轻摆动，这种应该是不贴壁吧）

3.目前细胞的形态是既有规则圆形的，也有长圆形边上带小突起的，细胞数目比较少，没有集落形成，请问“长圆形边上带小突起”细胞是DC前体细胞吗？

4.培养第二天的DC前体细胞是紧密贴壁的吗，还是说前期的DC就是疏松贴壁半悬浮生长的？如果不紧密贴壁可以养出来DC集落吗？

小弟目前做了两次都是这种情况，很是郁闷，特向各位前辈请教。

这是第1天无血清贴壁6h，弃去上清后的图片，细胞当时都是贴壁的，请问这些都是单核细胞吗？还是说里面大部分还是淋巴细胞？

这是加了细胞因子换用含10%FBS的1640全培养基后第三天图片，红色的箭头指的是贴壁细胞，请问绿色箭头豆芽状（悬浮的）的是什么细胞？图中绝大部分是悬浮细胞（随培养瓶移动而摆动），不会这些悬浮的细胞都是淋巴细胞吧？那前体DC就少得可怜。。。。（这是4ml血提取的PBMC种在25cm·2    培养瓶里）

望各位前辈们不吝赐教，小弟感激不尽。