细胞复苏不贴壁

我在中科院已订购两次SCSP-5035 Neuro-2a小鼠神经母细胞瘤细胞。可是这个细胞每次冻存再复苏后就开始不贴壁，长不起来，直至最后死亡的现象。第一次购买的细胞冻存复苏后均养不起来。这一次新购买的细胞冻存复苏后仍出现相同的现象，24h后肉眼观看培养瓶可以观察到贴壁现象，但培养液中依旧存在大量悬浮细胞，在培养液中呈流沙状。显微镜下观看的图片我会附在下面。请大家帮帮忙，拜托。

我的冻存液配方是参照贵院给出的说明书：95%完培（完培配方是10%胎牛血清+1%双抗）＋5% DMSO（细胞级）。冻存条件是：4℃ 30 min，-20 ℃ 1h，随后转移至-80 ℃过夜，第二天转液至液氮罐中长期保存。（-80 ℃冰箱与液氮罐存在三个楼层的距离，路程中用泡沫盒放入3个冰袋进行保冷转运）。

我的复苏条件是：

1.液氮中迅速取出细胞，放入一次性PE手套中，迅速拿到预先开好37℃的水浴锅中解冻，水浴锅中解冻时间为2min。（冻存管浸在水中时没有没过冻存管盖子，防止污染。摇晃解冻。）

2. 15ml离心管提前装9ml完培。解冻好后，洗脸巾擦干瓶身水渍，提前拿好的酒精棉擦拭冻存管，然后拿进操作台，拧开瓶口后放酒精灯前转两圈后用移液枪吸取细胞，缓慢一滴一滴的打入(避免渗透压不平衡对细胞造成损伤！)，而后去离心1000r 3min。

3. 离心后，倒掉上清。用无菌巴士吸管吸2ml培养基重悬。（怕细胞刚复苏状态脆弱，没敢先用移液枪吹打，选择用吸管缓慢轻柔吹打(避免产生气泡)，吹打至肉眼不可见细胞沉淀后，改换用移液枪轻柔缓慢吹打10下左右，而后用吸管轻柔转移至加好培养液的培养瓶中，放入培养箱。（整个康宁T25培养瓶中培养体系为5ml）

培养液：gibco 货号：11965-092，胎牛血清：gibco澳洲原装进口 货号：10099141C

胰酶、双抗、PBS：biosharp

培养瓶、离心管：康宁

“细胞版4月活动”