CRISPR文库构建时涂板菌总是长得太少怎么办？
发布于 2017-03-10 · 浏览 3011 · IP 上海上海
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我用PCR扩增sgRNA文库oligo片段，胶回收，浓度约16ng/ul。载体用BsmBI 酶切，55度过夜，胶回收，浓度19ng/ul。然后用T4连接酶22度连接1小时，电转2ul连接产物至感受态细胞，37度摇1小时，然后涂15cmLB板过夜。正常应该长至少一万克隆，可是我的板只有一两千。怎么办？挑了几个克隆做一代测序测不出信号。
我用感受态附带的质粒做了质控，可以长七八千克隆，说明感受态和电转程序都没有问题。用过NEB的Gibson连接酶，长的克隆反而更少。
做了两个多月一直是这样，急求帮助啊！能帮忙找到问题的可以有额外红包奖励~~谢谢了！
最后编辑于 2017-03-10 · 浏览 3011
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