【求助】流式测定人TH17细胞
发布于 2015-12-16 · 浏览 6601 · IP 浙江浙江
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请教各位老师战友，小弟最近刚开始做流式，是做人的th17细胞。
标本：肝素钠抗凝外周血
方法：
提PBMC或者是全血裂红都试过，然后刺激用PMA 50ng/ml+ionomycin 1ug/ml+BFA 3 ug/ml+monensin 1.4ug/ml四个小时，培养液用RPMI1640（含10%的胎牛血清），染表面抗体 CD3 CD8，然后破膜染IL17，由于了解到刺激后CD4 会发生内吞，所以用CD3阳 CD8阴来反设。
刺激阻断剂以及抗体用的是Ebioscience公司，固定破膜剂用的是联科公司。
现在存在的问题是阳性细胞非常少，TEST和CONTROL组没有区别，甚至无法检测到。求助啊！
问题：
1.无菌要求要多高？
2.最重要的是该怎么改进?
请各位老师指导，最好能参考下结果好的老师的protocol，谢谢！
标本：肝素钠抗凝外周血
方法：
提PBMC或者是全血裂红都试过，然后刺激用PMA 50ng/ml+ionomycin 1ug/ml+BFA 3 ug/ml+monensin 1.4ug/ml四个小时，培养液用RPMI1640（含10%的胎牛血清），染表面抗体 CD3 CD8，然后破膜染IL17，由于了解到刺激后CD4 会发生内吞，所以用CD3阳 CD8阴来反设。
刺激阻断剂以及抗体用的是Ebioscience公司，固定破膜剂用的是联科公司。
现在存在的问题是阳性细胞非常少，TEST和CONTROL组没有区别，甚至无法检测到。求助啊！
问题：
1.无菌要求要多高？
2.最重要的是该怎么改进?
请各位老师指导，最好能参考下结果好的老师的protocol，谢谢！
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 6601
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