【求助】引物高GC，高TM，PCR老扩不出来
发布于 2015-09-07 · 浏览 3558 · IP 广东广东
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各位战友，最近设计的一对引物，用于扩CDS序列，加入了酶切位点，引物如下
Forward primerTTTGCGGCCGCATGGAGGGCGCCGGC
Reverse primerCGGGGTACCTCAGTTAACTTGATCCAAAGCTCTG
扩增的片段大小约2500bp.由于高正向引物高GC，TM值是65℃（没加酶切位点时），一开始用60℃的退火温度没跑出来，后来用用LA酶扩，加了GC buffer，使用段落PCR条件如下
94℃ 3min
94℃ 30S
60-48℃ 30S 一度两个循环
72℃ 2min30s
以后用48℃ 在跑20个循环
72℃ 10min
就是扩不出来，模板的话，我用了QPCR引物去扩，是可以有条带的，说明我的cDNA是含有该序列，可是就是扩不出来，请各位战友指教，或者需用怎样的反应体系，拜托了！谢谢
Forward primerTTTGCGGCCGCATGGAGGGCGCCGGC
Reverse primerCGGGGTACCTCAGTTAACTTGATCCAAAGCTCTG
扩增的片段大小约2500bp.由于高正向引物高GC，TM值是65℃（没加酶切位点时），一开始用60℃的退火温度没跑出来，后来用用LA酶扩，加了GC buffer，使用段落PCR条件如下
94℃ 3min
94℃ 30S
60-48℃ 30S 一度两个循环
72℃ 2min30s
以后用48℃ 在跑20个循环
72℃ 10min
就是扩不出来，模板的话，我用了QPCR引物去扩，是可以有条带的，说明我的cDNA是含有该序列，可是就是扩不出来，请各位战友指教，或者需用怎样的反应体系，拜托了！谢谢
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 3558
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