【讨论】冰冻切片免疫荧光

本人新手，最近在做大鼠脑组织（海马）突触受体的免疫荧光，由于第一次做，所以完全按照文献来做，但是结果全是阴性，除了组织折叠的地方有一点荧光残留，其余目标部位一点荧光都没有，现在将我的过程献上，请各位前辈多多指教：
1、大鼠麻醉后PBS、3%多聚甲醛关注固定，取脑后4%多聚甲醛固定3-4小时，取目标区域（前囟后约3-8mm）脑组织，修整脑组织约5mm厚，至30%蔗糖脱水约14h沉淀；
2、将脑组织冻于-80度冰箱，次日取出后冰冻切片20μm，切片后分2种情况：（1）自然晾干切片后PBS洗3*5min；（2）切片后直接进PBS清晰3*5min。之后关于用不用3%过氧化氢处理，我两种方法都试过，经过处理后不论是否晾干基本都掉片了（用的粘附载玻片）；所以后来就直接跳过这一步；
3、10%羊血清在37度恒温箱封闭抗原1h，之后PBS 3*10min洗片；
4、保湿盒标记一抗（abcom，1：100-1：500）（1）37度90分钟（2）4度过夜，PBS 3*10min洗片；
5、37度保湿盒避光标记荧光二抗（life technology，1：100-1：1000）1h，PBS洗片3*10min；
6、直接荧光显微镜下观察，多次试验都未见荧光（阴性）。
通过以上过程及在园子里讨论发现如下问题：
1、大鼠脑组织冰冻切片做免疫荧光到底是否需要灌注、固定？
我看前辈讨论说灌注固定主要是保持形态完整，除此之外是否还有其他原因？请假前辈们有如下答案：（1）灌注固定后不能做免疫荧光，要是做免疫荧光需要新鲜组织直接液氮冻了做切片；（2）需要灌注来保持组织形态完整，同时固定蛋白？
2、多聚甲醛灌注固定组织是否需要抗原修复？
搜索园子战友讨论有以下意见：（1）多聚甲醛灌注固定不需要抗原修复；（2）多聚甲醛灌注固定还是需要抗原修复；
3、切片是（1）晾干/37度烤干？（2）丙酮固定？（3）不等干了直接做下游实验？
根据我做了几次来看如果不干直接做下游实验很容易掉片。
针对以上问题及困惑还望有经验的前辈给予指导，万分感谢！！！