你还在为冰冻切片制作而苦恼吗？（经验分享）

本人研究的是脑相关的疾病模型，总与动物的脑打交道，当然石蜡切片与冰冻切片也没少做。借此机会写一下我做冰冻切片中的一些体会，希望新手少走弯路。

 我目前的制作流程是:

冷生理盐水灌流，随后冷的4%PFA灌流固定 （第一天）

取脑，将脑切成3-4mm脑片后（大鼠或更大的动物脑在此步骤需要切片，小鼠脑则不用），放到4%PFA中4度冰箱固定过夜。（第一天）

第二天早上从4%PFA中取出脑片，用纸吸掉表面的液体，放入10%蔗醣中（4度冰箱）直到组织沉底（一般4小时），再转入15%蔗醣中（4度冰箱）直到组织沉底（一般也是4小时），晚上回家前，将脑片转到20%蔗醣中（4度冰箱）过夜。（第二天）

第三天，取出脑片，用纸吸干表面的液体（尽量吸的彻底），OTC包埋，液氮速冻。（也有人不用OTC包埋，直接将脑片放在用锡纸做的小盒子里，液氮速冻。）（第三天）

以上是整个流程，下面我说说相关的体会

1.     是整个脑固定脱水还是切成3-4mm脑片后再固定脱水?

如果是小鼠，整个脑放入固定液和脱水液中也是没有问题的，如果为了加快整固定和脱水的速度，建议将不需要的部分切掉（比如你主要观察大脑，你可以将小脑和脑干切掉）。

如果是大鼠或更大的动物脑，则需要切成3-4mm脑片，否则，由于组织太厚，固定液和脱水液渗透到脑中心部位需要很长时间。尤其是固定液，如果组织固定的不够及时，细胞的坏死比较严重，抗原不能很好的保留。如果固定液固定的不够充分，则后续的脱水过程会让细胞有明显收缩。

2.     蔗醣的浓度设定?

我用的是10%， 15%， 20%的梯度脱水法，个人认为这样足够了，虽然也有人用30%的蔗醣溶液。

配制蔗醣用的是0.1M PB （pH=7.4）

以下的配方，配储存液0.2M PB（pH=7.4，无需调节pH值，因为这样的配比pH刚好约7.4），

0.2M PB，配3L的量，需要如下：

NaH₂PO4・2H₂O     17.784g

Na₂HPO4（无水）   69g

使用时需稀释成0.1M PB，再溶解蔗醣。

3.     包埋时需要注意的事项

包埋前一定要吸干脑片表面的液体，放入装有OTC包埋剂的塑料小盒或者锡纸做的小盒内，将需要切的那面朝下，轻轻将脑片压到小盒底部使切的那边水平，再填充OTC将整个组织都包埋在其内即。将小盒底部接触液氮表面，千万不要放太深，更不能有液氮进入小盒内，否则组织容易冻裂。（速冻过程约1min以内）

速冻好的组织块密封好置于-80度保存，经本人验证保存一年没有问题（一年以上的没有用过）。

4.     切片前的准备及切片时的注意事项

切片前，将组织从-80度取出，放切片机里（-20度）平衡3小时。

平衡好后，在固定架上涂上薄薄一层OTC，将包埋好的脑片放上去，然后置于切片机里的冷冻台上冷冻，数分钟后涂抹的OTC变白，可开始切片。

切片时，将载玻片放在切片机玻璃板上（切片机的玻璃盖子）预热，切完的脑片，用预热过的载玻片去贴片不容易有褶皱，本人发现切片过程中玻璃盖子是产热的，利用这个温度预热载玻片效果非常好（可以在上面同时放上数张待用的载玻片）。贴片时，让载玻片倾斜一定角度去贴片，有利于展片。切完的片子，冷风干燥1小时，即可进行染片，或者放到密封盒内置于 -80度保存。下次染片时，从-80度取出后立即冷风干燥半小时再染色。

5.     是否用OTC包埋组织

本人做了两组实验，用OTC包埋和不用OTC包埋，切10um以下的片子，发现不用OTC包埋的脑组织切片时，切片过程很顺利（几乎不会卷片），但是贴片时非常不顺利，贴完的片子有很多细小的褶皱。而OTC包埋过的脑片就不存在贴片困难的问题，小褶皱几乎没有。 如果切20um的片子，可以用4度左右的冷水去展片，无论是否包埋过OTC，在这里没有太大区别，只要将切完的片子，用镊子夹到冷水里，之后立即捞片即可（这时的载玻片不需要预热）。注意，用冷水展片时，一定要将装冷水的杯子暂时放在切片机里，然后用镊子将片子夹起放入冷水中。把脑片拿到切片机外面去展片的话是不现实的，因为脑片很快就融化了。

6.     切冰冻切片一定要心静！如果心情不是太好就不要在这一天切片子，一定要在relax的状态下去切片，否则越切越烦躁，也得不到满意的片子。

以上是我的个人见解，不足之处请批评指正。