【交流】Caspase的结构、功能及调控

　　凋亡（或程序性细胞死亡）是一个生理性的细胞自我毁灭的过程，在胚胎发育、生物体内环境的稳定及多细胞生物防御外在及内在伤害方面均起着非常重要的作用。凋亡过程的紊乱，可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如肿瘤、自身免疫性疾病、神经退行性变及局部损伤等[1]。能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、能够引起染色体损伤的药物、细胞自身表达的一些受体分子等。凋亡细胞表现出一些共同的特征，如形态学的改变（包括胞膜小泡的形成，细胞的皱缩，凋亡小体的形成），生物化学特性的改变（如胞膜内环磷脂酰丝氨酸的外翻，DNA的片断化，细胞骨架的解离，细胞内功能蛋白的降解等）[2]。对细胞凋亡的机制，人们进行了深入的研究，在以往研究的基础上，大致可以把凋亡分为Caspase依赖的和非Caspase依赖的凋亡。本文着重对Caspase依赖的凋亡过程中的Caspase分子特性作一综述。
　　Caspase分子是一类在进化上非常保守的蛋白酶类分子。Caspase的含义表现在两个方面（１）他们为半胱苷酸蛋白酶类，并且把半胱氨酸作为对底物裂解时的亲核基团，（２）他们为天冬氨酸蛋白酶类，切割天冬氨酸的羧基与下一个氨基酸的氨基形成的肽键。人们对Caspase在凋亡中起重要作用的认识来自于一些试验观察（１）天然和合成的Caspase抑制剂可以显著降低甚至阻断多种刺激引起的细胞凋亡，（２）一些Caspase基因敲除动物模型表现出明显的无凋亡现象，（３）Caspase催化裂解众多的细胞内功能蛋白分子，这些裂解的分子可以导致细胞凋亡[3]。Caspase分子除了在凋亡过程中起重要作用外，在炎症过程中也起重要作用。Caspase分子以酶原的形式被合成，并且在体内低水平组成性表达。外部或内部的刺激引起Caspase分子以瀑布式的活化方式活化。活化的Caspase分子催化裂解众多的效应分子，诱发细胞凋亡。
Caspase的结构和酶活性

　　自从第一个Caspase分子（Caspase－１）被发现以来，在哺乳动物已经发现了１４种同源分子，在果蝇中发现了５种同源分子。从结构上进行分析，这些同源物均含有一个高度同源的酶活性区域，该区域可以被切割为大约２０KD和１０KD的两个片断，在一些Caspase分子如Caspase－３，大小两个片断以Linker相连。根据Caspase分子酶活性区域的相似性，可以把Caspase分子分为三大类（１）与炎症有关的Caspase分子，包括Caspase-1、-4、-5、-11、-12、-13和-14，（２）包括Caspase-2和-9，（３）包括Caspase-3、-6、-7、-8、-10。Caspase分子的另外一个显著特点是以酶原的形式被合成，这些酶原的氨基端有一段长短不一的肽段，被称为Prodomain。Prodomain与Caspase分子功能密切相关。与炎症相关的Caspase分子的Prodomain长度大于100个氨基酸，而功能性Caspase分子的Prodomain长度则小于30个氨基酸。长的Prodomain往往含有明显的功能域，如DED（death effector domain）,CARD(Caspase recruitment domain)，DID(death inducing domain)等。Caspase-8和-10均含有两个重复的DED功能域，而Caspase-1、-2、-4、-5和-9均含有CARD功能域，在果蝇的DREDD中含有DID功能域。这些功能域参与Caspase分子之间的相互作用及Procaspase DE活化及Caspase分子的亚细胞定位等[4,5,6,7,8]。短的Prodomain的功能可能是抑制Caspase的活化[9]。最近的研究发现Linker中的一些氨基酸序列也有明显的生物学作用，如Caspase-3的Linker中的DDD序列参与Procaspase-3的稳定[10]。Procaspase分子的三维结构人们目前还无法知道，但DED，CARD等功能域的三维结构已经被认识，他们均由６个a－螺旋构成，外形上非常相似，但仍有一些差异，主要表现为功能域相互作用的方式不尽相同。如电荷－电荷相互作用主导CARD-CARD之间的作用，而疏水相互作用主导DED-DED之间的作用 [11,12,13]。
　　对活化Caspase的结构的研究发现，活化Caspases均为由大小两个亚基构成的异四聚体，大小两个亚基对于酶的活性均是必需的。利用Caspase的抑制物已经将一些活化Caspase分子的三维结构研究的比较清楚。如Caspase-8，Caspase-3等。这些研究显示，活化Caspase为四聚体，两个小亚基相邻排列，两个大亚基围绕在小亚基的周围；每一大小亚基形成一球状分子，球状分子的核心为６个α螺旋环绕的6个β片层样结构。两个异二聚体以小亚基相连。每一活化Caspase分子含有两个酶活性中心，这两个活性中心可能独立发挥作用。在Caspase-1分子中，Cys-285，His-237， Arg-179（大亚基）和Arg-341（小亚基）组成酶的活性中心。结构研究还显示，在Procaspase到活化Caspase的过程中，大亚基的羧基端和小亚基的氨基端顺势相邻有利于形成正确的酶活性中心[14,15,16,17,18]。对Caspase酶活性中心的研究主要是依靠特异性抑制剂及突变技术。如在对Caspase-1的研究中，发现Caspase-1的活性可以不可逆的被半胱苷酸蛋白酶抑制剂（带重氮甲基酮的多肽）所抑制，起他的能够修饰半胱氨酸的类似物如碘乙酰胺、N－乙酰马来酰亚胺也可以抑制Caspase-1的活性；其他一些丝氨酸、天冬氨酸、金属蛋白酶抑制剂不能抑制Caspase-1的活性。以上结果被突变技术及三维结构的研究所证实。与其他半胱氨酸蛋白酶相类似，Caspase分子对过渡期金属元素比较敏感，如Zn2+ 可以明显抑制多种因素诱导的凋亡，其机制可能是Zn2+干扰了活性中心的正确形成 [19,20] 。
　　Caspase分子是非常特异的内肽酶，其酶作用的底物要有四个排列正确的四个氨基酸及相邻氨基酸[21,22]。如图所示，P1位必须是天冬氨酸，P2、P3、P4位上氨基酸的组成，不同的Caspase分子的要求不同。应用positional scanning synthetic combinatorial library(PS-SCL)的方法[23]，我们现在已经可以对不同的Caspase分子的底物特异性有一大概了解。根据Caspase对底物的识别不同，Caspase分子可以分为三大类，第一类的特异识别位点是WEHD，包括Caspase-1、-4、-5。第二类的特异识别位点为DETD，包括Caspase-2、-3、-7、CED3。第三类的特异识别位点为（L/E）EXD，包括Caspase-6、-8、-9、-10。以上仅仅是粗粗的分类，其实，同一类的不同的Caspase分子对相同的底物的亲合力是不同的，如Caspase-1和Caspase-4对WEHD的亲合力常数分别为0.056和97，这说明Caspase-1比Caspase-4的酶活性更强[24]。除了P1-P4位外，P1′（切割位点后的第一个氨基酸）的氨基酸种类也很有特点，常常为Ala、Ser、 Asn等小分子的氨基酸。在体外试验中，P1′位只要是甲酰胺就足以引起正确地切割。必须注意的是，体外实验的结果并不能完全代表体内实验的结果，因为在体内，酶对底物的切割更易受到蛋白分子内相邻氨基酸残基的影响。
Procaspase的活化

　　尽管人们对凋亡的机制及Caspase分子特性了解很多，但Caspase分子是如何被活化的，仍是一个有争论的话题。对initiator caspase的活化始于对caspase 在大肠杆菌表达的研究．这些表达的procaspase分子能够完全和准确的活化，但是在这些研究中，所使用的蛋白浓度非常高，并不能代表细胞内的真正情况．对procaspase的真正意义上的活化的研究始于procaspase-8．当受到FasL的作用后，Fas的细胞内肽段募集Procaspase-8，引起Procaspase-8的寡聚化，继而活化。由此提出Procaspase-8的活化是由于其寡聚化引起的，体外实验中寡聚化可以引起caspase－８的活化。Procaspase-9的活化是由于Apaf-1引起其寡聚化后而活化的。事实上，由寡聚化而使蛋白活化是细胞内的一个广泛的机制。但近来的研究却发现，由突变引起的Processing位点缺失的Procaspase-9仍能诱导凋亡，而且其Prodomain参与全酶的形成。这些结果提示Initiator caspase的自我切割并不是寡聚化介导的caspase活化的首发条件。另外一个利用定点突变方法是相邻的Procaspase分子一个缺失Processing位点，另一个缺失酶活性位点，均不能使两个Procaspase分子活化。这些结果似乎提示还有其他活化Procaspase的途径[25,26,27,28]。
　　效应caspase的活化可能有两条途径：一是由Initiator caspase对其切割后活化的，另外是通过反式活化途径。现在已经证明了的活化途径包括受体介导的caspase的活化和线粒体介导的caspase的活化。反式活化需经两个步骤。以颗粒酶B对caspase-3的活化对反式途径加以描述。颗粒酶对caspase-3的切割首先发生在Linker区域，产生一个具有部分酶活性的中间体，该中间体与成熟酶在结构上很相似，然后，中间体进行自我切割，切去Prodomain，形成活化的caspase-3。IAPs（inhibitor of apoptosis）对caspase的抑制作用之一就是抑制Prodomain的自我切割[29,30,31,32]。非常有意思的是，Procaspase-3可以被含有R-G-D Motif的短肽所活化，该种活化机制不清，但Procaspase-3在活化部位的RGD motif及linker区域中所含有的RGD结合序列，可能参与了这种作用。
Caspases 分子在凋亡过程中的位移

　　Procaspases分子为细胞的组成性表达分子，主要分布于胞液中。在各种刺激诱导的细胞凋亡过程中，不同的caspases分子位移到不同的亚细胞区域，发挥不同的作用。
胞浆－胞膜之间的位移