书籍《树突状细胞与肿瘤免疫治疗》
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第一章 树突状细胞的细胞学基础
第一节 树突状细胞的命名与分类
一、树突状细胞的命名与分布
1973年，美国Rockfeller大学Steinman和Cohn教授首先从小鼠脾脏中分离出一群胞质呈星状突起、核极不规则的细胞，乃命名为树突状细胞（dendritic cells，DC）。此后，Steinman等在1973年至1979年间，对该细胞进行了系列研究，从小鼠树突状细胞的形态、数量和组织分布，小鼠树突状细胞的体内外功能特征，小鼠脾内树突状细胞的识别和分布，到小鼠脾树突状细胞的纯化、表面标志和体外培养，诸多方面做了大量的实验工作，并将研究结果总结成5篇极有价值的研究论著，连续发表于J Exp Med杂志上公诸同好，从而得到了学术界的公认，确立了树突状细胞是一类具有独特形态的新型细胞群体，是一类极强的MHC携带细胞，有强有力的免疫刺激力和抗原提呈能力。顿时，树突状细胞成为一类新型的免疫辅助细胞，令人瞩目。
树突状细胞在体内分布甚广，全身除脑以外，各脏器皆有树突状细胞分布。由于不同部位树突状细胞在发育程度、表型及功能等方面不完全一致，甚至有很大差异，因此，树突状细胞又有不同的命名。树突状细胞主要的分布及其命名如表1-1-1所示。
体内树突状细胞的分布虽然广泛，但数量却极微，为痕量（trace）细胞群体。如在人外周血单个核细胞中，树突状细胞仅占1% 以下；在小鼠脾脏单个核细胞中，树突状细胞量更少，仅占0.2% ~ 0.5%。 如此微量的树突状细胞， 又无特异性的标志，在一般染色中无法加以鉴别，分离更为困难，致使树突状细胞在70年代末被确认后，虽以其强有力的抗原提呈功能引起高度重视，但终因分离培养方法不成熟而给研究带来重重困难，导致一度陷入困境，甚至有些学者对于树突状细胞的研究是否能够深入下去产生了怀疑的态度，乃于80年代中期对树突状细胞的研究转入低谷。直到1992年，Steinman实验室首先建立了用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating-Factor，GM-CSF）从小鼠骨髓中大规模培养制备树突状细胞的方法，此后很快成功地利用GM-CSF加白细胞介素4（Interleukin 4，IL-4）从人外周血单个核细胞，或用GM-CSF加肿瘤坏死因子α（Tumor Neucrosis Factor α，TNF-α）从CD34+造血干细胞中扩增到大量树突状细胞，才使树突状细胞的研究重新进入高潮，并取得突飞猛进的进展。
二、树突状细胞的类型
早期的树突状细胞研究已对分布于不同部位的树突状细胞冠以不同的命名，近年来，随着对不同组织来源树突状细胞功能特点研究的逐步深入以及对树突状细胞的起源、分化发育研究的重大进展，人们发现了树突状细胞发育成熟过程中的迁移特性，进而认识到不同部位的树突状细胞与其所处的分化发育阶段有密切的关系。通过对大量动物和人的体内外实验结果加以总结，学者们提出体内树突状细胞可以主要归为两大类型，即髓系树突状细胞和淋巴系树突状细胞。至于滤泡树突状细胞（FDC），则视为一类特殊类型的树突状细胞。
1．髓系树突状细胞（Myeloid-derived DC）
髓系树突状细胞是研究最早和最广泛的一类树突状细胞，通常所称的树突状细胞，即常规树突状细胞皆指髓系树突状细胞。目前已知髓系树突状细胞起源于骨髓多能造血干细胞，与粒细胞、单核巨噬细胞有共同的前体——髓系前体。体内分布的外周血树突状细胞、交错突细胞、面纱细胞、郎格罕细胞和间质树突状细胞均为髓系树突状细胞的不同分化发育阶段。髓系树突状细胞的强大免疫提呈功能是其它专职抗原提呈细胞所不及的。髓系树突状细胞高表达激活T细胞所需的一系列分子，其激活T细胞的能力是巨噬细胞和B细胞的10 ~ 100倍，回输树突状细胞甚至可以打破经典的新生期小鼠同种移植耐受的诱导生成。更独特的功能是髓系树突状细胞能激活初始型T细胞，因此作为免疫应答的启动者是其它专职抗原提呈细胞所不可替代的。
近来的研究发现，非成熟的髓系树突状细胞可以通过巨胞饮（macropinocytosis）、受体介导的内吞方式（receptor-mediated endocytosis）和吞噬（phagocytosis）三种途径摄入抗原。所谓巨胞饮方式，即细胞膜在细胞骨架作用下形成大的皱褶，然后摄取液体形成巨大的巨胞饮泡（1~3μm）。树突状细胞通过巨胞饮方式非特异、非饱和地摄入大量的可溶性抗原，此强大的液相吞饮能力可部分弥补其缺乏特异性抗原受体的缺点。受体介导的内吞方式则具有高效性、选择性和饱和性的特点，细胞借助细胞膜表面的受体可以有效地捕捉到浓度很低的相应抗原。树突状细胞虽然没有特异性抗原受体，但其表达FcγRⅡ、甘露糖受体（mannose receptors），这些受体能分别有效介导树突状细胞对抗原-抗体复合物、甘露糖/岩藻糖化抗原的摄取。在小鼠树突状细胞，其表达的DEC-205也属于巨噬细胞甘露糖受体家族，能介导糖基化抗原的摄取。吞噬是细胞摄取大颗粒或微生物（0.5μm以上）的一种内吞方式。在树突状细胞发育的某些特定阶段，如从皮肤中新鲜分离的郎格罕细胞体外可以摄取完整的细菌、0.5~3.5μm的溶胶微粒，肝脏等部位的树突状细胞能吞噬大颗粒，但与巨噬细胞强大的吞噬功能有显著的差别。
髓系树突状细胞在成熟过程中，摄取抗原的能力下降，而提呈抗原的能力增强。成熟树突状细胞不仅可以经MHCⅡ类分子途径提呈外源性抗原给T辅助细胞，而且可以经MHCⅠ类分子替代途径提呈抗原肽段给细胞毒性T细胞，后一途径对诱导CTL产生特异性杀伤肿瘤的作用有重要意义。
在外源性抗原的MHCⅡ加工提呈过程中，摄入的抗原被细胞内的内吞系统分解成抗原肽，并转运至一种富含MHCⅡ的多层膜结构—MIIC（major histocompatibility complex class Ⅱ compartmant）中。MIIC可能是抗原肽与MHCⅡ结合的潜在部位。MIIC 呈多泡状，内含多层膜，直径约200~300nm；具有某些溶酶体特性，如微酸性、含β氨基已糖苷酯酶、组织蛋白酶D、溶酶体相关膜蛋白1（lysosome-associated membrane proteins-1，LAMP-1）/CD63，但无酸性磷酸酶和β-葡萄糖苷酯酶，也无晚期内吞体标志6-磷酸甘露糖受体。内吞标记物在接触细胞30~60分钟后能进入MIIC，并与MIIC 中来自内质网的MHCⅡ类分子结合成抗原肽-MHCⅡ复合物，然后迅速表达至细胞膜表面，与周围许多T细胞接触形成多细胞聚合体，从而有效地把抗原决定簇以抗原肽-MHCⅡ类分子复合物的形式提呈给CD4+T辅助细胞，以进一步发挥免疫效应。此外，体外分离的MIIC 还能激活抗原特异性的T杂交瘤细胞。
近年来的研究发现，树突状细胞与其它抗原提呈细胞一样，还可将通过吞噬和巨胞饮方式摄入的外源性抗原以MHCⅠ类分子替代途径加工，提呈的抗原进而被CTL表面的TCR识别，以发挥对靶细胞的特异性杀伤溶解作用。有关MHCⅠ类分子替代途径中对外源性抗原的加工处理机制尚不十分清楚，但目前认为，至少存在两种不同的加工途径。一种途径是，当外源性抗原通过某种机制从内吞系统中逃脱出来，进入胞质途径，即经典的MHCⅠ类分子途径，抗原被胞质中的蛋白酶体（proteasome）降解成8~10个氨基酸短肽，然后通过抗原肽转运体（TAP）依赖机制将抗原肽运输至内质网，在内质网中抗原肽与新合成的MHCⅠ类分子结合形成抗原肽-MHCⅠ复合物，最后通过分泌小泡的方式表达在细胞膜表面以激活CD8+CTL。German用不全消化模式（indigestion model）解释此途径，他认为，如果抗原提呈细胞内吞适量的外源颗粒结合抗原（经脂质体包裹、乳胶微粒交联、铁微粒交联等产生），并能保持胞吞/吞噬系统膜的完整性，抗原提呈细胞即通过MHCⅡ类分子途径对抗原进行加工提呈；一旦抗原提呈细胞内吞过量的外来颗粒结合抗原，吞噬体的“超载”导致不全融合体的产生或吞噬体质膜的破裂，使抗原泄漏到胞质中，便进入经典的内源性抗原MHCⅠ类分子提呈途径。而经巨胞饮方式摄入的可溶性抗原，可以直接进入MHCⅠ类分子替代途径提呈，然提呈颗粒结合抗原比提呈可溶性抗原效率更高。另一种途径是，抗原加工处理是TAP非依赖性的，不依赖于经典的胞质加工机制和内质网/高尔基复合体系统，抗原肽可能在高尔基复合体后的囊泡小区（如吞噬体和吞噬溶酶体）由蛋白酶降解后再与已装配好的MHCⅠ类分子结合，共同表达于细胞表面；或者通过抗原肽回流，使其跨膜回到细胞外，于细胞表面与MHCⅠ类分子结合，最终由CD8+T细胞识别。髓系树突状细胞如此强大的抗原提呈能力在免疫激活和肿瘤免疫中发挥重要的作用。
最近的研究还表明，在未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞同时存在的情况下，能更有效激活CD4+和CD8+T细胞；另加上肿瘤细胞凋亡小体，激活树突状细胞的效率就更明显。这是由于未成熟树突状细胞摄取、加工抗原的功能与成熟树突状细胞提呈抗原、激活T细胞的功能相互协同的结果；加上吞噬肿瘤调亡小体的树突状细胞能促使自身成熟并将抗原提呈给T细胞，进一步激发T细胞增殖，诱导特异性CTL生成，因而提高了抗肿瘤功能。
有关髓系树突状细胞的分化发育、形态特征、分子表达及其与T、B细胞关系等其它细胞学基础，髓系树突状细胞的分离扩增，髓系树突状细胞与肿瘤免疫等方面的研究，将在以后各章节逐一介绍，在此不再赘述。此外，以后各章节介绍的髓系树突状细胞，均通称为树突状细胞。
2．淋巴系树突状细胞（lymphoid-related DC）
淋巴系树突状细胞是起源于骨髓多能造血干细胞的另一类树突状细胞，其前体细胞不同于髓系树突状细胞，而是与T细胞、B细胞和NK细胞有共同的前体——淋巴系前体，均来自淋巴定向干细胞。虽然目前对淋巴系树突状细胞的具体分化发育过程尚不清楚，但是对于淋巴系树突状细胞来源于淋巴系前体这一观点，则已被诸多实验所证实。如在IL-1存在的条件下，体外培养的CD4-、CD8-、SIg-、MHCⅡ+的小鼠胸腺细胞可分化为树突状细胞。将分离的骨髓和胸腺CD4-、CD8-、CD3-、CD44+、CD25+的前体细胞，注射入经γ射线照射的同系小鼠胸腺后，可同时检测到树突状细胞和T细胞的生成。而从人体组织中分离出来的CD4+、CD11b-的T细胞亚群，经过IL-3培养，也可产生具有刺激T细胞作用的树突状细胞。又如，将CD4loT细胞前体静脉注入经亚致死量照射的同基因小鼠，可产生T细胞、B细胞、胸腺树突状细胞和脾树突状细胞，而缺乏髓系和红系细胞的分化。CD19+前B细胞在体外加入IL-1β、IL-3、IL-7、TNF-α、c-kit配体（SCF）和人Flt3配体培养时，可获得具有CD11C、DEC-205、CD80、CD86、MHCⅡ分子的树突状细胞。近年来又发现人类骨髓中存在的CD34+、CD10+、Lin-（无系特异性细胞表面标志的细胞）前体细胞乃T细胞、B细胞、树突状细胞和NK细胞的共同祖先，在胸腺内也存在T细胞、树突状细胞和NK细胞的共同前体，这些前体细胞在骨髓和胸腺微环境作用下，向不同的细胞系分化。
胸腺微环境对诱导骨髓来源的多向潜能干细胞向淋巴系细胞分化起着重要的作用。如小鼠骨髓干细胞在脾内能分化为CD8α+树突状细胞和CD8α- 树突状细胞，CD4loT细胞前体在脾内只能分化为CD8α+树突状细胞；而在胸腺内，无论是骨髓干细胞，还是CD4lo，皆单一分化为CD8α+树突状细胞。目前认为，CD8α+ 树突状细胞是小鼠胸腺树突状细胞的特征性标志，表明在胸腺微环境作用下，骨髓多向潜能的干细胞以同一前体向淋巴系细胞分化。
此外，淋巴系前体细胞的分化还受细胞因子的影响。如小鼠胸腺前体细胞在IL-1α和TNF-α作用下向T细胞系分化；而在IL-3、IL-4、IL-7、TNF-α、Flt3L、SCF和抗CD40抗体等5~7种细胞因子混合作用下，经4天培养却诱导出典型的淋巴系树突状细胞；GM-CSF对小鼠淋巴系树突状细胞的分化发育则无影响，这一点正与髓系树突状细胞的分化发育相反。人胸腺前体细胞分化为树突状细胞系与小鼠所需的细胞因子不完全相同，如从人胸腺中分离出来的CD34+、CD33lo前体细胞，在IL-7、IL-1β、IL-6、GM-CSF、SCF混合培养的条件下，能诱导分化为树突状细胞；而加入IL-2，则同时获得了树突状细胞和NK细胞。有趣的是，作为小鼠胸腺树突状细胞特征性标志的CD8α，在人胸腺树突状细胞却不表达；而在小鼠胸腺树突状细胞呈低水平表达的CD4，在人胸腺树突状细胞却为高水平表达。此类差异的生理意义目前尚不清楚。
成熟的淋巴系树突状细胞主要存在于小鼠和人的胸腺和次级淋巴组织的T细胞区，特别是胸腺内树突状细胞，是用于体外研究淋巴系树突状细胞的主要对象。关于淋巴系树突状细胞的功能特性，目前了解还不多，有待进一步研究。但从现有研究资料来看，已知淋巴系树突状细胞与髓系树突状细胞在功能上差异甚大，髓系树突状细胞的主要功能为加工处理和提呈外源性抗原（包括自身细胞衰老、突变等产生的抗原），而淋巴系树突状细胞主要参与中枢和外周的免疫耐受，在胸腺的淋巴系树突状细胞——胸腺树突状细胞，还是T细胞阴性选择的主要承担细胞。
众所周知，机体有核细胞的表面均有MHC分子，它代表个体的特异性。个体所有细胞表面MHC分子的特异性是完全相同的，而同种异体之间及种属之间的MHC分子皆不相同。MHC分子是淋巴细胞识别自己和异己细胞，以及在自身细胞之间进行免疫协同作用的重要标志。树突状细胞对胸腺细胞的选择及T细胞MHC限制性功能的形成密切相关。
阴性选择是胸腺内发生的T细胞耐受，即自身反应T细胞克隆，通过TCR-肽-MHC复合物的相互作用得以清除的过程。当普通胸腺细胞表面表达CD4、CD8和TCR时，胸腺上皮细胞和胸腺树突状细胞即通过细胞表面的两类MHC分子对胸腺细胞进行严格的阴性选择，只有那些功能与自身MHC特异性相适应的胸腺细胞（2%左右）才能被选择性地留下来并继续发育，其余不适合的细胞均将注定死亡。现认为这种死亡是通过一种自杀机制，即细胞内启动了一种DNA内切酶，使细胞核内的DNA长链全部断裂成许多无用的短链，以致细胞凋亡并被吞噬清除。选择的机理尚未完全明了，但实验已证明胸腺上皮细胞可诱导T细胞克隆的清除。如胸腺皮质上皮细胞可有效处理、提呈抗原给携带有对肽-MHC复合物高亲和力TCR的自身反应皮质DP（double positive）胸腺细胞，诱导此胸腺细胞凋亡。但由于胸腺皮质上皮细胞的抗原提呈功能有限，有人认为胸腺上皮细胞仅可选择性诱导识别内源性合成肽的MHC-Ⅰ限制性胸腺细胞的克隆清除，而对于外来抗原，只有当其在皮质以高浓度存在时，才能发生针对外来抗原的MHCⅡ限制性T细胞在DP阶段被阴性选择。然而，胸腺树突状细胞对抗原的内吞处理潜能及共刺激分子的存在，决定了它可诱导胸腺皮质上皮细胞所不能诱导的T细胞阴性选择。体内外实验均表明，胸腺树突状细胞可诱导针对特异性MHC分子、次要组织相容性抗原、循环蛋白、病毒抗原、病毒或细胞超抗原的T细胞阴性选择。有人发现可溶性的循环抗原更易接近髓质，这提示针对外来抗原的MHCⅡ限制性T细胞的阴性选择主要发生在髓质和皮、髓质交界处。而对胸腺树突状细胞参与阴性选择的分子机制，目前还知之甚少。
至于体内存在的一类特殊类型的树突状细胞——滤泡树突状细胞，其来源至今还存在很大争议。有人鉴于抗原转运细胞（Ag-transproting cells，ATC）向淋巴滤泡的迁移及其与滤泡树突状细胞表型的相似性，而假设ATC为滤泡树突状细胞的前体细胞；有人认为滤泡树突状细胞来源于次级淋巴组织的基质细胞；也有人认为滤泡树突状细胞可来源于初级淋巴组织中的祖细胞。
滤泡树突状细胞缺乏白细胞共同抗原CD45，但表达一些特征性分子，如CD11b、CD21ey、CD35。FDC存在于次级淋巴细胞的B细胞区生发中心，包括脾脏、淋巴结、扁桃体和肠道的Peyer’s结节。在正常机体中，滤泡树突状细胞的主要功能在于维持活化的B细胞活力及B细胞的生长发育。FDC能通过其表面的免疫球蛋白受体（FcR）和补体受体（CR）捕获抗原抗体复合物，这种以免疫复合物形式存在的抗原，能长时间（数月）表达于FDC表面并保持其特有的抗原性，并将抗原加工、提呈给T细胞，因此，滤泡树突状细胞作为外来抗原的储存库能在体内诱导和激发很强的记忆性免疫应答。在此过程中，滤泡树突状细胞不仅能将抗原特异性信号传递给B细胞，还能给B细胞提供非特异性信号，这两种信号对生发中心的形成和二次免疫应答的诱导和维持是非常重要的。
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（张锦堃）
第二节 树突状细胞的分化发育
一、树突状细胞的分化、发育和成熟
90年代以来，大量体外实验研究为人们认识树突状细胞的分化、发育和成熟过程提供了极为有益的资料，至今对髓系树突状细胞的分化发育过程已基本清楚。Austyn将树突状细胞的分化发育过程概括为四个阶段：①树突状细胞的前体；②未成熟期树突状细胞；③迁移期树突状细胞；④成熟期树突状细胞。
1、树突状细胞前体的分化
① 树突状细胞前体的确定
70年代Steinman等提出树突状细胞起源于骨髓，与单核/巨噬细胞有共同的前体。到90年代初期，Reid等人先后采用含有GM-CSF和其它细胞因子的凝集素条件培养基以及含有GM-CSF和TNF-α的无血清培养基，对人骨髓和外周血单个核细胞进行培养，终于首先鉴定出树突状细胞/郎格罕细胞的造血祖细胞克隆，进一步明确了树突状细胞起源于骨髓，并提出人骨髓树突状细胞的前体细胞实际上为CD34+干细胞。此后，大量实验证实了这一观点。例如young等在GM-CSF、TNF-α和c-kit配体的协同作用下，从CD34+前体细胞中诱生出CFU- DC，继而全部分化为的树突状细胞。将其转移到液体培养基后，细胞能活跃运动，伸出面纱样或薄片状的突起，高表达HLA-DR，而缺乏CD14，具有很强的同种异体刺激活性。又如在体外甲基纤维素半固体培养体系中发现，单独应用GM-CSF诱导，CD34+前体细胞只能分化为粒细胞和巨噬细胞，不产生树突状细胞。而将GM-CSF和TNF-α联合应用，则能诱生出两类克隆，一类是典型的CFU-GM，含有粒细胞、巨噬细胞和少量树突状细胞；另一类克隆则全部由树突状细胞组成，即CFU-DC。两类克隆诱生的树突状细胞有相同的特性。这些结果都表明树突状细胞来源于CD34+干细胞，并在机体内存在独立的树突状细胞系（dendritic cell lineage）（图1-2-1）。
进一步的分析表明，人骨髓CD34+干细胞可分化为粒细胞、单核/巨噬细胞和树突状细胞三系细胞克隆的基本规律是，CD34+细胞先分化出CFU-GM，CFU-GM中绝大多数在G-CSF作用下分化、发育为粒细胞（CFU-G），少数在GM-CSF作用下分化为CFU-Mo-DC， CFU-Mo-DC在M-CSF作用下，进一步分化为单核/巨噬细胞（CFU-M）；而在GM-CSF、TNF-α作用下，则进一步分化为CFU-DC，生成树突状细胞前体细胞，并离开骨髓进入外周血（图1-2-2、1-2-3）。
② CD34+前体细胞的分化途径
当CD34+干细胞被确定是树突状细胞的前体后，人们又致力于对CD34+细胞的研究，以探索CD34+细胞向树突状细胞定向分化的途径及其定向分化的发生阶段。
Szabolcs等通过对一种来自骨髓CD34+干细胞的被称为后-CFU双向潜能中间型（post-CFU potential intermediate）细胞的研究，发现在c-kit配体、GM-CSF和TNF-α存在的条件下，post-CFU可进一步分化为树突状细胞；而在没有外源性细胞因子存在，或仅有M-CSF存在时，则发育成巨噬细胞。一旦上述分化完成后，再用细胞因子作用，树突状细胞与单核/巨噬细胞之间便不能相互转化。若将树突状细胞再置于M-CSF中培养，树突状细胞不但不能变为巨噬细胞，反而发生死亡；同样，将巨噬细胞置于GM-CSF和TNF-α中培养，也不能转变成树突状细胞。提示终末分化是不可逆的。
Caux等用人脐血CD34+细胞置于含有c-kit配体、GM-CSF和TNF-α的培养基中诱导5~7天后，发现细胞分为CD14+、c-fms+、CD1a-和CD14-、c-fms-、CD1a+两类亚群。继续培养，CD14+、CD1a-细胞可分化为巨噬细胞或树突状细胞，但这些树突状细胞缺乏Birbeck颗粒；而CD14-、CD1a+细胞则先分化为具有郎格罕细胞特征的细胞，含有Birbeck颗粒，表达Lag抗原和钙粘素E（E-cadherin），至培养12~14天，再进一步分化为成熟的树突状细胞。Strunk等发现从人外周血分离到的CD34+干细胞分为两类，一类是CD34+、CLA+（皮肤淋巴细胞相关抗原）、CD45RA+、CD71lo，另一类是CD34+、CLA-、CD45RAlo、CD71+，两群细胞均可在体外由GM-CSF和TNF-α联合诱导生成树突状细胞，但仅前者可生成含有Birbeck颗粒的郎格罕细胞（图1-2-4）。由此可见，在发育早期，树突状细胞的系统发育定向已被确定。这样，树突状细胞的分化发育过程可归纳为两条定向途径：一是CD34+细胞先分化为CD14-、CD1a+细胞，经过郎格罕细胞阶段，再分化为成熟树突状细胞；一是CD34+细胞先分化为具有双向分化特性的CD14+、CD1a-的中间阶段细胞，然后在M-CSF作用下分化为巨噬细胞，而在GM-CSF和TNF-α作用下分化为成熟树突状细胞，CD14和c-fms也随之丢失（图1-2-5）。
目前认为，两条定向途径发育而来的树突状细胞，均能在体外培养12~14天成熟为具有典型树枝状突起的树突状细胞，表达CD80、CD83、CD86、CD58，也高表达HLA-DR，有强大的激活初始型T细胞的能力和抗原提呈功能，将抗原提呈给T细胞，从而诱导细胞免疫。但两者发育过程的不同又决定了它们在功能上有一定差异，如捕捉抗原的能力、甘露糖受体和非特异性酯酶的表达等。特别引人注意的是，仅有来源于CD14-、CD1a+的树突状细胞才能诱导处女型B细胞在CD40和IL-2作用下分泌IgM，因此，这一来源的树突状细胞可能除了参与细胞免疫以外，也参与体液免疫。
2、未成熟期树突状细胞
树突状细胞分化发育过程中均经过未成熟期树突状细胞阶段。在CD14-、CD1a+定向发育途径中，郎格罕细胞即为未成熟期树突状细胞，主要分布于表皮和粘膜的上皮组织中；而在CD14+、CD1a-定向发育途径中，未成熟期树突状细胞主要分布于非淋巴器官的间质中（除脑以外），也称间质树突状细胞。
未成熟期树突状细胞缺乏几种主要辅助分子，如CD40、CD54、CD58、CD80和CD86，而这些分子正是与树突状细胞抗原提呈作用密切相关的分子，也是与树突状细胞对T细胞的激活作用密切相关的分子，故这类树突状细胞刺激初始型T细胞的能力很弱。但未成熟期树突状细胞表达一些膜受体，如FcγRⅡ、人甘露糖受体或鼠DEC-205分子，这些受体与介导树突状细胞摄入抗原密切相关，同时，这类树突状细胞也能通过巨胞饮和吞噬作用摄取抗原。如用GM-CSF和IL-4体外培养人外周血单个核细胞获得的非成熟树突状细胞能通过巨胞饮持续摄入大量液相标记物LY（lucifer yellow），单个树突状细胞每分钟可摄入50μm3液体。新鲜分离的皮肤郎格罕细胞可摄入细菌和溶胶微粒，但并不能象巨噬细胞那样吞噬红细胞及胶体碳，而且在体外培养72小时后，郎格罕细胞的吞噬功能明显下降。可见，树突状细胞发育过程中，摄取抗原的能力主要表现在未成熟阶段。
未成熟期树突状细胞含有一些重要的细胞器，如内质体（endosome）、MIIC、CIIV和溶酶体等，这些细胞器受到学者的高度重视。如用GM-CSF体外培养小鼠骨髓细胞，在细胞发育早期，即培养的第4~5天，其细胞膜表面几乎不表达MHCⅡ，而在细胞内却含有丰富的MHCⅡ，这些MHCⅡ分布于细胞核周围区域的MIIC 内。继续培养至6~7天，其内的MHCⅡ大部分位于靠近细胞膜表面的外周区域，存在于类似CIIV的小泡中。再培养至8~10天，细胞发育进入晚期，成熟为具有典型形态和表型的成熟树突状细胞，其膜高表达MHCⅡ，而细胞内的MHCⅡ却很少。未成熟期树突状细胞内的MHCⅡ类分子的分布状态类似于发育早期的树突状细胞，此阶段树突状细胞将抗原和新合成的MHCⅡ积聚在MIIC 内有利于抗原加工及抗原肽-MHCⅡ复合物的合成，但新合成的抗原肽-MHCⅡ复合物仍被滞留在MIIC 内，以避免抗原在外周组织中被过早提呈。可见，未成熟期树突状细胞所含的细胞器与MHCⅡ类分子的合成、MHCⅡ类分子与抗原结合以及MHCⅡ类分子的再循环等功能密切相关。此外，这类树突状细胞还能分泌一些趋化因子和具有炎性介质作用的细胞因子，如郎格罕细胞能产生TNF-α、IL-1、IL-6、IL-15等。因此，未成熟期树突状细胞是外周非淋巴组织中处于抗原加工期的树突状细胞。
3、迁移期树突状细胞
未成熟期树突状细胞在体内必须经历一个迁移过程，进入迁移期树突状细胞阶段。迁移期树突状细胞主要存在于输入淋巴管、外周血、肝脏血液和淋巴组织，通过淋巴管和/或血循环迁移，最终到达周围淋巴器官。树突状细胞的迁移过程是树突状细胞发育成熟的重要过程，也是树突状细胞摄取抗原能力逐渐下降、抗原提呈功能逐步增强的重要过程，而趋化因子/趋化因子受体系统在这一过程中起着十分重要的作用。
树突状细胞表达多种趋化因子受体，受趋化因子趋化。趋化因子受体属于G蛋白偶联受体超家族，在胞内区与G蛋白偶联，参与信号传导。当信号从受体传至G蛋白时，细胞内产生第二信号，于是细胞骨架重新组合，细胞局部粘附形成，并通过伪足的延伸和缩短使细胞与周围介质发生粘附或脱离，最终使细胞发生定向迁移。在树突状细胞分化发育过程中，其趋化因子受体的表达谱会发生一些改变，因此不同发育阶段的树突状细胞对不同趋化因子的反应性不同。在正常情况下，体内绝大多数树突状细胞处于未成熟阶段，未成熟树突状细胞表达高水平CCR1、CCR2、CCR5、CXCR1、CXCR2和CXCR4等趋化因子受体，对CC趋化因子包括MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MCP-3有明显的趋化反应性，但对CC趋化因子MIP-3β和CXC趋化因子SDF-1α反应性较弱。这些CC趋化因子能诱导未成熟树突状细胞向外周组织迁移，使之接触并接受抗原刺激信号，然后继续向成熟树突状细胞方向发育。
4、成熟期树突状细胞
最近研究表明，迁移期树突状细胞在接受某些刺激因子或抗原（如LPS、TNF-α、IL-1β）刺激后，其原先于未成熟期存在的对CC趋化因子的反应性基本丧失，相反，对原先反应较弱的MIP-3β和SDF-1α（基质细胞来源的趋化因子）的反应性却明显升高，与这些反应性相关的趋化因子受体CCR5表达减低而CXCR4表达增多。日本学者还发现，成熟树突状细胞选择性地表达CCR7，其配基ELC/MIP-3β可选择性地诱导成熟树突状细胞迁移（而对未成熟树突状细胞无此作用），即诱导表达CCR7并已携带抗原信息的成熟树突状细胞从外周组织（如炎性部位）迁移至淋巴器官，归巢至T细胞区。在与静息T细胞接触后，树突状细胞获得进一步的分化成熟信号，使其成为功能上完全成熟的树突状细胞，从而激发T细胞免疫反应。
二、CD34+前体细胞发育为髓系树突状细胞的替代途径
在髓系树突状细胞分化发育的研究中，除了直接采用分离纯化的CD34+干细胞外，还常用人外周血单核细胞、小鼠脾脏单个核细胞等，也能诱导分化出功能成熟的树突状细胞。可见，CD34+干细胞分化发育为树突状细胞尚存在替代途径。
1、单核细胞分化为树突状细胞
单核细胞向树突状细胞分化与CD34+干细胞向树突状细胞分化有密切关系。在CD34+干细胞向树突状细胞分化过程中，曾出现向树突状细胞和巨噬细胞双向分化潜能的CD14+、CD1a-细胞，因此，有学者提出，在这一系统发育过程中，CD14+前体分化而来的单核细胞可能还保持双向分化潜能，乃试图由单核细胞直接诱生树突状细胞。目前，这一推论已成为事实。
实验证明，GM-CSF与IL-4或IL-3联合应用，皆能诱导人外周血单核细胞分化为树突状细胞，但所诱生的树突状细胞在形态、表型和功能方面都表现为未成熟型细胞的特点，如表达CD1a、RelB，低表达CD80、CD86和CD58，同时也表达单核细胞的标志CD11b、CD36、CD68及c-fms，不表达树突状细胞终末成熟的标志CD83和p55（55 kd Actin-Bundling Protein）。这类树突状细胞的胞质内出现MIIC，在功能上能通过受体的介导有效地摄取抗原，也有吞噬作用，但刺激初始型T细胞的功能很弱。培养基中加入胎牛血清较加入人血清或血浆诱生树突状细胞的能力稍强，但在去除细胞因子后，上述细胞均失去树突状细胞的特征；反之，若给以一定的刺激信号，这些细胞就继续分化成熟并表现出成熟树突状细胞的特征，包括细胞的树突状形态、高表达辅助分子CD80、CD86和CD58等，而失去单核细胞的标志，在功能上能将MHCⅡ类分子转运到细胞表面并能启动初始型T细胞反应，但失去摄取抗原的能力。促使这类树突状细胞成熟的因子有多种，如TNF-α可诱导GM-CSF和IL-4胎牛血清培养的树突状细胞终末分化。在单核细胞条件培养基中，不必加入胎牛血清，用GM-CSF和IL-4诱导7天，也可促使树突状细胞终末分化，这可能是单核细胞条件培养基中存在着某些使树突状细胞不可逆终末分化所必需的因子。Odeherty等在长时间的研究中发现，单核细胞培养基中的TNF-α、IL-1β、IL-6和INF-α起了重要的作用。若只是这些因子联合应用或各自单独应用，均不能完全代替单核细胞条件培养基。Akagawa 等研究表明，单核细胞受M-CSF作用向巨噬细胞分化，或受GM-CSF作用向树突状细胞分化，都是可逆的；然而，加上TNF-α，则使单核细胞上的M-CSF受体丢失，使单核细胞向树突状细胞的分化变为不可逆。Paluck等研究也证明了这一点，并认为单核细胞是树突状细胞和巨噬细胞的共同前体，而成熟树突状细胞则为单核细胞分化后的终末期细胞。炎性刺激因子LPS、前列腺素等也能诱导树突状细胞的终末成熟，是通过CD40L-CD40的作用来完成的。Trance等还发现，由T细胞提供某些TNF超家族成员的信号，如CD40L，也能促进树突状细胞终末分化，并促进其功能成熟（图1-2-6）。此外，在促进单核细胞诱生树突状细胞的细胞因子中，以IL-13代替IL-4，即GM-CSF与IL-13联合应用，也可获得同样的效果。
然而，体内单核细胞是否能不断进入组织并自动分化发育为树突状细胞，或受炎性刺激而分化发育为树突状细胞呢？若果真能如此，则更有利于将其应用于临床而使之发挥与原代树突状细胞相类似的作用，因此，这是目前的研究焦点之一。Barratt-Boyes等将黑猩猩的单核细胞分离出来并经GM-CSF和IL-4联合培养诱导产生的树突状细胞，通过静脉回输至体内后，发现很多细胞归巢至淋巴结T细胞区。但至今尚未见这类细胞归巢至脾脏的报道。关于单核细胞在体内如何转化为树突状细胞，Andolph认为，当单核细胞穿过内皮细胞从组织进入淋巴时，单核细胞通过与内皮细胞间相互作用而分化为未成熟树突状细胞，淋巴中的面纱细胞可能就是这类树突状细胞。若单核细胞吞噬了颗粒，经内皮返回淋巴管时，这类细胞仅仅需要48小时，而不是8~10天，便可分化为树突状细胞，这些树突状细胞具有MIIC所具有的溶酶体相关膜蛋白LAMP标志和p55标志；这类树突状细胞进一步分化成熟，可高表达MHCⅡ和CD86，但不表达单核细胞的标志，如CD14、CD32和CD64。但在生理状况下单核细胞向树突状细胞分化的问题，尚待进一步研究。
2、脾细胞来源的树突状细胞
在开展树突状细胞研究的早期，树突状细胞的主要来源就是从脾单个核细胞分离而来。脾细胞分离的树突状细胞得率较低，一般处于其发育的某一阶段，尚未完全成熟，但只需在体外给予一定的刺激信号或细胞因子，如LPS、TNF-α、IL-1β等，就能使其很快进入成熟期。因此，脾细胞来源的树突状细胞虽不利于用以对其分化发育的研究，也不利于用来开展过继回输免疫治疗实验，但用于研究影响树突状细胞成熟的因素有一定价值，而对于研究树突状细胞的生物学特性和功能则有更高的价值。
三、细胞因子在树突状细胞分化发育中的作用
在树突状细胞的分化发育过程中，细胞因子起着重要的调节作用。有些细胞因子，对树突状细胞的分化发育起促进作用。自90年代以来，正是利用这些细胞因子的作用，从体外扩增培养出大量的树突状细胞。但是，也有一些细胞因子对树突状细胞的分化发育起抑制作用，如IL-10，是一种具有免疫抑制特性的细胞因子（图1-2-7）。IL-10能阻止GM-CSF和IL-4联合诱导的人外周血单个核细胞向树突状细胞分化，抑制经LPS刺激的树突状细胞向成熟分化，也能于体内抑制外周炎症刺激因子诱导树突状细胞成熟。IL-10又能有效抑制树突状细胞表面经CD40诱导IL-12的生成，还可直接下调外周血树突状细胞表面B7-1、B7-2、ICAM-1和MHCⅡ类分子的表达。其中B7-2分子的表达下调后，导致CD28/CTLA-4的结合位点减少，从而抑制这些树突状细胞对静止期T细胞的刺激能力，乃至抑制增殖反应及T细胞产生IL-2和IFN-γ的能力。可见，不同的细胞因子在树突状细胞的分化发育中起着不同的作用，在此我们选择一些应用于体外扩增培养树突状细胞的细胞因子加以描述。
1、常用的细胞因子
目前，最常用的细胞因子是GM-CSF、TNF-α和IL-4等，通过联合应用GM-CSF和TNF-α诱导CD34+干细胞向树突状细胞分化，而联合应用GM-CSF和IL-4诱导单核细胞向树突状细胞分化。在上述基本因子作用下，为进一步促进树突状细胞的分化发育，也加用一些其它细胞因子，如干细胞增殖分化的早期细胞因子SCF等。
GM-CSF不仅能诱导一系列特征性启动因子（start factor）的表达以启动树突状细胞的分化，促进MHCⅡ-树突状细胞干细胞群、MHCⅡ+树突状细胞干细胞群和未成熟树突状细胞发育，而且还能上调树突状细胞表达CD86，使成熟树突状细胞活化，在树突状细胞的分化发育中起着关键性的作用。TNF-α也是树突状细胞早期发育乃至整个发育过程中所需的细胞因子，TNF-α在树突状细胞终末分化中的关键作用不容忽视。如体外分化发育的小鼠骨髓树突状细胞，在最后两天的成熟阶段，TNF-α对树突状细胞的成熟有明显的促进作用。在单核细胞衍生树突状细胞的发育过程中，具有双向分化潜能的单核细胞在GM-CSF作用过程中加入TNF-α，使单核细胞丢失M-CSF受体，向树突状细胞分化则变为不可逆。GM-CSF与TNF-α联合应用还进一步发挥了二者的协同作用，TNF-α作为第一信号，上调树突状细胞前体的GM-CSF受体，使其达到一定的阈值，以接受GM-CSF的刺激，引导前体细胞向树突状细胞分化；在整个树突状细胞发育阶段，TNF-α能维持树突状细胞的GM-CSF受体的高水平，保证了GM-CSF作用的充分发挥。IL-4对巨噬细胞生长有抑制作用，因此IL-4与GM-CSF协同作用可促使CD14+细胞向树突状细胞方向分化，并能增强未成熟树突状细胞摄取抗原的作用，从而促使其发育成熟。
最近的研究表明，IL-3与TNF-α协同作用可诱导CD34+干细胞向树突状细胞分化，CD40L也可诱导GM-CSF依赖性树突状细胞的分化发育；体内实验也表明，输入Flt3L可促使淋巴器官中成熟树突状细胞数量明显增多。如此看来，GM-CSF并非是完全不可替代的。
2、其它细胞因子
① TNF家族的其它成员
TNF家族中的一些细胞因子可以替代或增强TNF-α的功能，近年来受到高度重视的CD40就是其中之一。CD40/CD40L结合后，启动了树突状细胞的成熟过程，促使树突状细胞发生重要的、向成熟细胞方向发展的形态学变化，诸如胞质减少、树枝状形态增多、表型改变等，特别是保持树突状细胞 MHCⅡ类分子的高水平表达，上调CD80、CD86、CD58等辅助分子的表达。当树突状细胞表面MHC-抗原肽与T细胞TCR/CD3结合后，CD40/CD40L的结合又使树突状细胞表面的CD80、CD86表达进一步增加，并与配体CD28、CTLA4结合，为T细胞活化提供共刺激信号。CD40/CD40L结合还可以刺激CD34+干细胞进入DNA合成期，引起CD34+干细胞增殖，这一作用是CD40特异性的，因为它能被Anti-CD40单抗及Anti-CD40L单抗所阻断。CD40/CD40L也可诱导CD34+干细胞分化为树突状细胞，这类树突状细胞不表达CD10和CD40，但表达CD26，高表达转换激活因子rel-B，刺激T细胞的功能也较弱。CD40/CD40L的作用不依赖于GM-CSF，而GM-CSF对树突状细胞的作用更强，是CD40/CD40L的2倍。
最近，又发现TNF家族的另一个成员——TRANCE能上调Bel-XL的表达，成熟树突状细胞高表达TRANCE受体，当其与TRANCE结合后，能通过抑制树突状细胞凋亡来延长树突状细胞的寿命，维持对T细胞的持续刺激力。
② IL-3和IL-13
IL-3与GM-CSF有交叉作用，IL-13则与IL-4有交叉作用。IL-3能协同TNF-α促进脐血CD34+干细胞向树突状细胞分化，与GM-CSF作用相似。IL-3似乎可以替代GM-CSF的功能，这也可以解释GM-CSF缺陷小鼠为何能维持正常造血功能和有正常的脾树突状细胞。在外周血单个核细胞分化为树突状细胞时，IL-13又可替代IL-4的作用。
③ Flt3配体
Flt3配体（FL）是酪氨酸激酶受体的配体，近年来发现Flt3配体与c-kit配体相似，在树突状细胞的分化发育中起促进作用（图1-2-7）。如在GM-CSF与TNF-α联合诱导CD34+干细胞向树突状细胞分化的培养基中，追加Flt3配体后，Flt3配体可与CD34+细胞表面的Flt3特异性结合，进一步促进细胞增殖。Flt3配体与Flt3结合后，还能显著延长造血干细胞在无血清培养基中存活的时间，有利于纯化的脐血造血干细胞或前体细胞的短期储存、处理和运输。体内实验表明，Flt3配体可促使小鼠体内树突状细胞大量增加，也可促进健康人外周血树突状细胞大量增加，其扩增量高达30倍。然而，在培养体系中单独或联合应用Flt3配体和c-kit配体，均不能改变CD34+细胞来源的树突状细胞表型，可见Flt3配体与c-kit配体的作用相似，只能促使树突状细胞扩增，而不能诱导树突状细胞分化。
④ TGF-β1
TGF-β1是又一种重要的细胞因子。Strobl等发现CD34+干细胞分化为CD1a+、Lag+，含Birbeck颗粒的郎格罕细胞，除需要GM-CSF和TNF-α外，还需要TGF-β1和c-kit配体；而用Flt3配体介导的郎格罕细胞的发育也需要TGF-β1的支持。Flt3配体与c-kit配体都是通过为TGF-β1提供向郎格罕细胞分化的关键信号而促使CD34+细胞分化为郎格罕细胞，因此，TGF-β1是郎格罕细胞分化的必需因子（图1-2-7）。
此外，IL-1能增强GM-CSF促进树突状细胞成熟的功能，并能促进树突状细胞与T细胞结合，增强成熟树突状细胞的抗原提呈功能和激活初始型T细胞的作用。
四、树突状细胞的寿命
在体外，树突状细胞的存活依靠细胞因子和刺激分子来维持，当上述因子缺乏时，树突状细胞一般只能存活数天，甚至迅速死亡；分离的小鼠脾树突状细胞存活时间较长，可达十余天，但细胞活力在存活过程中明显减弱。而在GM-CSF存在的条件下，可维持数周至三个月。在体内，根据实验方法、种属和器官等不同，树突状细胞寿命自3天至4周不等，而在皮肤可能较长。树突状细胞在摄取抗原后，其提呈能力可维持数天。但对树突状细胞在完成抗原提呈功能活化T细胞以后，其命运又当如何，目前知之甚少。最近研究表明，淋巴结内的成熟树突状细胞在提呈抗原后，自身很快出现凋亡。目前已知成熟树突状细胞高表达TRANCE受体，而TRANCE可通过上调Bel-XL表达而抑制树突状细胞凋亡，能延长成熟树突状细胞的存活期。然而，有关如何防止树突状细胞死亡，树突状细胞死亡时发生什么变化等问题，尚有待进一步探讨。
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（张锦堃）
第三节 树突状细胞的形态特征
树突状细胞在分化发育过程中，其形态结构也发生相应的改变。本节着重介绍成熟树突状细胞的结构特点，简述树突状细胞在体外生长过程中的形态变化。
一、成熟树突状细胞的形态特征
1、光镜下形态
① 树突状细胞的活细胞形态
倒置相差镜下，树突状细胞悬浮生长，大小不等，形态极不规则，向四周伸出不同数量的粗细不一、形态迥异的胞质突起，有的短而粗，末端呈钝圆的伪足样；有的细而长，形成许多参差不齐的多分支的树枝状，表面呈毛刺样；也有的两者兼有。细胞突起在培养液中不停地摆动或迅速持续地伸缩，致使其方向和形态不断地改变。核大而不规则，常呈扭曲状，有折光和明显搏动。胞质内有致密颗粒，为线粒体；偶有折光性强的脂滴存在。（图1-3-1,1-3-2）。若悬液中存在淋巴细胞或淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine-activated Killer，LAK），则可见树突状细胞周围有淋巴细胞（L）或LAK细胞聚集现象，少则2~3个细胞，多则4~25个细胞，分别形成DC-L或DC-LAK细胞簇。两者比较，DC-LAK较DC-L形成的细胞簇较大，聚集的细胞较多。
② 涂片中树突状细胞的形态
树突状细胞涂片用常规方法染色，在形态上与单核巨噬细胞不易区分，用细胞化学法染色也不易清晰地显示树突状细胞的全貌。如在PAS反应中，树突状细胞呈阴性反应，在碱性磷酸酶（ALPase）、腺苷三磷酸酶（ATPase）和过氧化物酶（Poase）反应中，树突状细胞也呈阴性。在酸性磷酸酶（AcPase）反应中表现不一，可为阴性，也可在核凹陷处有大圆点状的黑色反应产物，或在核附近有数个细小的黑色反应颗粒。在普鲁士蓝（Prussian blue）反应中，细胞膜表面附有许多蓝绿色铁微粒，而细胞质呈阴性反应。因此，采用与单核巨噬细胞有鉴别意义的多抗，如S-100蛋白，或采用与树突状细胞的表面分子相对应的单抗，如Ia、HLA-ABC、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD54、CD80、CD86、CD83等等作为一抗，进行免疫细胞化学或免疫荧光染色，则可借助阳性反应的结果清晰地显示出树突状细胞的形态。
涂片中呈阳性反应的树突状细胞，其胞体大而多突起，突起的数量和形态各异。突起和胞质内充满阳性反应产物，在免疫细胞化学反应中，显示出与显色剂颜色相应的弥散或细颗粒状的阳性反应产物，如用DAB显色，可显示棕黄色；在免疫荧光反应中，则发出与荧光剂色彩相应的强荧光，如用FITC标记，可显示黄绿色荧光（图1-3-3）。细胞核也大而极不规则，时有扭曲。在悬液涂片中，还常见树突状细胞借助细长的突起相互接触，或见数个树突状细胞聚集成群。若悬液中存在淋巴细胞，也可见树突状细胞与淋巴细胞形成花环，花环中央为呈阳性反应的树突状细胞，其周围围绕着淋巴细胞（图1-3-4）。
③ 切片中树突状细胞的形态
在淋巴结和脾脏的石蜡切片或冰冻切片中，应用相应的免疫组织化学染色法，均可见呈阳性反应的树突状细胞。在淋巴结中，树突状细胞位于副皮质区，多为散在分布，也可呈小片状或小索状分布；在脾内，树突状细胞位于白髓动脉周围淋巴鞘内，以鞘的中外层为多，单个散在分布。切片中树突状细胞胞体较大，胞质较多，而突起较短而钝，胞质和突起内也充满弥散或颗粒状的阳性反应产物，核的形态不一，这些都与切面有关。单个存在的树突状细胞也常与周围的淋巴细胞结合形成花环。石蜡切片与冰冻切片中的树突状细胞形态无明显差异。
2、电镜下形态
① 扫描电镜下树突状细胞的形态
在细胞悬液中，被固定的树突状细胞仍保持其特征性的突起，使细胞呈星状、多角形或极不规则形。突起长短不一，分支形成1~4级的亚突起。突起的形态差异更大，有细长针刺样突起，有鳞茎状、花瓣状、钝圆伪足状突起，也有船帆状薄片样突起，薄片甚至可长达数微米。同一细胞可兼有不同形态的突起。树突状细胞的胞体和突起表面光滑，无明显小棘、皱褶或微绒毛（图1-3-5~1-3-10）。在悬液中有淋巴细胞存在时，树突状细胞同样与淋巴细胞聚集成簇。
② 透射电镜下树突状细胞的形态
超簿切片中的悬液树突状细胞，其胞体、突起和核因切面关系形态显得更为复杂，但细胞表面光滑，没有微绒毛。突起则呈多样化，有的呈丘状隆起，有的呈粗短指状，有的呈伪足样，有的弯弯曲曲，有的细而长，可向四周呈放射状伸出，也可盘曲呈环状，甚至有折叠现象。细胞核极度不规则，有时被切成互不相连的数块，常偏位，薄层异染质附于核膜下，偶见核仁。胞质量不等，一般电子密度较低，细胞器不发达，特别是溶酶体和吞噬体，或仅在核附近少量存在，或完全缺如；但有中等量核糖体和线粒体，线粒体多呈圆形或椭圆形，常成群存在，线粒体嵴较发达。（图1-3-11~1-3-14）。
二、树突状细胞前体在体外分化发育中的形态变化
倒置相差镜下，CD34+细胞呈圆形，胞体小，在培养液中悬浮生长。CD34+细胞受相应细胞因子诱导，在向树突状细胞分化发育的过程中，细胞体积逐渐增大，细胞形态逐渐从圆形变为梭形、逗点状、蝌蚪状、星形或不规则形。在生长过程中，单个散在的细胞逐渐聚集成簇状细胞集落。开始集落较小，由3~5个细胞组成；以后集落逐渐增大，可达10个以上细胞。集落边缘呈毛刺状，周围有形态典型的树突状细胞脱落。继续培养，细胞脱落增多，集落变小，集落数量也逐渐减少。脱落的细胞多为成熟树突状细胞，突起形态多样，有的短而粗，有的细而长、也有的多分支，但表面仍呈毛刺样；细胞核常扭曲，搏动明显。成熟树突状细胞在悬液中的活动甚为活跃（图1-3-15、1-3-16）。
电镜下，树突状细胞在分化发育过程中除形态相应改变外，最大的特点是经郎格罕细胞分化阶段发育而来的树突状细胞，在郎格罕细胞阶段，胞质内出现Birbeck颗粒，而进一步发育成熟，Birbeck颗粒也随之消失。Birbeck颗粒又名郎格罕细胞颗粒，该颗粒有界膜包被，呈扁盘状或星形，一端可有突出的球形泡。颗粒长15~30nm，宽约4nm，颗粒的纵切面呈杆状或网球拍形，杆的中央有纵向的致密线，其上有6nm周期的横纹。对于Birbeck颗粒的来源，看法尚不一致，有人认为是由细胞质膜内陷形成，有人则认为是高尔基复合体发生的泡形成。至于Birbeck颗粒的功能，目前知之不多，可能为消化细胞外物质的吞噬体，也可能是向细胞外释放某种物质的结构。在郎格罕细胞，则可能与摄取抗原的功能有关。
树突状细胞前体在体外分化发育过程中，另一形态学特征是细胞表面分子随着不同发育阶段发生相应的改变，这将在下一节“树突状细胞的分子表达”中详细描述。
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（张锦堃）
第四节 树突状细胞的分子表达
树突状细胞的分子表达非常复杂，不同种系、不同组织、不同类型的树突状细胞，有不同的分子表达；同一树突状细胞处于不同的分化发育阶段，有不同的分子表达；即使分化成熟的树突状细胞，其所处的功能状态的不同（如静止状态和被激活状态），还是有不同的分子表达。因此，树突状细胞的分子表达与其分化发育功能的关系一直为人们所关注，而进一步寻找树突状细胞特异性的分子表达更是树突状细胞的研究热点之一。
一、常用的树突状细胞的识别标志
目前有少数物种的某几个树突状细胞亚群的特异性或相对特异性表面分子得到确认，并用以作为识别这些树突状细胞亚群的标志。
1．小鼠树突状细胞
① 33D1：是小鼠脾脏树突状细胞一个亚群的特异性标志，33D1单抗是Steinman最早制备成功的一种小鼠脾脏树突状细胞的识别单抗。
② NLDC-145（DEC-205）：表达于小鼠脾脏树突状细胞另一个亚群上，也表达于淋巴结、胸腺等淋巴器官T细胞区的树突状细胞上，但胸腺皮质上皮以及激活的巨噬细胞也表达这一标记。DEC-205抗原的cDNA已被克隆，其编码的分子与巨噬细胞甘露糖受体有关。
③N418（CD11c）：小鼠树突状细胞高表达N418，包括小鼠脾脏树突状细胞的两个亚群，但激活的巨噬细胞也表达这一标记。
2．大鼠树突状细胞
OX62：大鼠树突状细胞高表达OX62，OX62单抗是大鼠脾脏树突状细胞的特异性识别单抗。
3．人树突状细胞
① CD1a：来源于骨髓、经CD14-/CD1a+ 中间阶段分化为郎格罕细胞，再进一步分化为树突状细胞的一个亚群，特异性表达CD1a。CD1a也是郎格罕细胞的识别标志。
② CD83：CD83在激活的人树突状细胞和体外培养的人树突状细胞均有表达，而在人体内生理性存在的树突状细胞和体外新鲜分离的树突状细胞则不表达，因而CD83被认为是树突状细胞充分成熟的标志。CD83功能不明，在小鼠中也未发现类似的表型。
③ CMRF-44：CMRF-44高表达于培养的人外周血树突状细胞上，但一小部分新鲜分离的人外周血树突状细胞和郎格罕细胞上也有表达，因而推测后者为部分分化/激活的树突状细胞亚群。目前，已应用CMRF-44单抗阳性选择这一树突状细胞亚群。然而，接受高剂量IFN-γ治疗患者，其体内的B细胞、单核细胞和巨噬细胞上也能低表达CMRF-44。
④ CMRF-56：CMRF-56是表达于培养的人外周血树突状细胞上的另一分化/激活标记，应用单克隆抗体双标记染色，发现CMRF-56与CMRF-44及CD83有明显不同。
⑤ Lag： Lag分子是郎格罕细胞表面另一特征性分子，其识别单抗是Lag单抗。
⑥ S-100：S-100蛋白虽然不是树突状细胞所特有的标记，但在人外周血及病理切片中，树突状细胞的形态最易与单核/巨噬细胞混淆，单核/巨噬细胞恰好不表达S-100蛋白，因此也常用S-100蛋白作为鉴别树突状细胞的标记。
然而，不同种系、不同组织来源的树突状细胞也有共同的特征：①组成性（constitutive）高表达MHC-Ⅱ类分子；②在成熟树突状细胞，高表达CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD40和CD54（ICAM-1）分子，在不成熟树突状细胞则低表达甚至不表达。因此上述分子也常用作为树突状细胞的识别标志。
二、树突状细胞体外发育阶段的主要分子表达
体外经GM-CSF诱导培养8天的小鼠骨髓单个核细胞悬液，不再表达早期前体细胞的标记CD34和CD31，并生成不同发育阶段的树突状细胞亚群。其中发育成熟的树突状细胞高表达MHC-Ⅰ、 IN-1（细胞内恒定链分子），共刺激分子CD80、CD86、CD40、CD54和中度的CD24，也表达树突状细胞NLDC-145 、CD25 （IL-2Rα）、2A1、M342 和MIDC-8。非成熟的MHC-Ⅱlow 亚群表达CD11c（N418）和CD13。单核/巨噬细胞的标记CD68（macrosialin）、CD11b（MAC-1）、CD14、 LY-6G（Gr-1）的表达随树突状细胞的发育成熟而逐渐减少。LY-6C和ER-MP58在成熟过程中逐渐消失。但F4/80和CD16可持续低表达，TNF-R p75在整个培养过程持续表达，而3D6（sialoadhesin）则始终呈阴性。
三、不同组织树突状细胞的分子表达
1. 人血树突状细胞
新鲜分离的 HLA-DR+CMRF-44+ 细胞表达CD54、CD11b、CD13、CD33和CD4，不表达CD83，为非成熟树突状细胞。经体外培养可进一步分化，发育为表达CD83、CD40、CD80、CD86， 而CD13表达下调的成熟树突状细胞。用HLA-DR++CMRF-44++分选可得到成熟的树突状细胞，表达CD83、CD40、CD86、CD80、CD1b、CD13、CD33、CD4和CD25。
M-DC8是用去T、B、Mo的人外周血单个核细胞免疫小鼠获得的单克隆抗体，外周血白细胞大约含有0.5-1% 的M-DC8阳性的细胞，用磁珠化M-DC8分离外周血，可获得97% 纯度的细胞，它们缺乏单核细胞标记CD14，B细胞标记CD19，T细胞标记CD2，NK细胞标记CD56， P55和CD83也呈阴性，而特异表达CD16（FcγⅢ）和CD64（ FcγⅠ），同时表达CD11c、CD45RA、CD54、CD86、和HLA-A、B、C 。经过36小时的短期培养，CD16转为阴性，而CD40、CD54、CD86、HLA-A、B、C、和HLA-DR等表达升高。
人CD14dim、CD33dim细胞为树突状细胞前体，而CD14dim、CD33bright则为进一步分化的树突状细胞，表达CD5、CD4、HLA-DR、HLA-DQ、CD58（LFA-3）、ICAM-1（CD54）和ICAM-2（CD102），不表达B7分子，经36小时的体外培养后，可上调辅助分子的表达，CD80、CD86的表达也升高。
2. 非淋巴组织的树突状细胞
非淋巴组织的树突状细胞可摄取处理抗原，产生MHC抗原肽复合物并表达于细胞表面，这些树突状细胞称为非成熟树突状细胞或抗原处理树突状细胞。它们分布于皮肤表皮以及呼吸道、胃肠道和泌尿道的粘膜，也存在于心和肾的间质中。一般从非淋巴组织分离的树突状细胞几乎不表达共刺激分子如CD40、CD80和CD86，体外刺激初始型T细胞的能力也很微弱。
新鲜分离的皮肤郎格罕细胞含有birbeck颗粒，表达CD1a、 CD1c、HLA-DR、HLA –DP和HLA -DQ分子，也弱表达或中度表达RFD1、 C3biR、FcγR、p150/95和HLA-A、B、C ，粘附分子 LFA-3 和ICAM-1，但不表达LFA-1和单核/巨噬细胞标记。 经体外培养后，Birbeck 颗粒、 C3biR、 FcγR 及p150/95 完全丢失，CD1a 和 CD1c显著减少或丢失，MHC-II 及 ICAM-1 表达如常，LFA-3 和MHC-I则显著升高，最显著的变化是表达交错突细胞的标记RFD1。而酶活性如ATP酶和非特异性酯酶活性不变，始终不表达单核/巨噬细胞的标记。
大鼠肝脏淋巴结切除术后经淋巴管重建，使肝脏淋巴液直接通过胸导管输出，并引流胸导管收获肝脏淋巴中的树突状细胞。16小时引流可获取5×105 非T、非B、MHC-Ⅱ+ 细胞，其中80% 的细胞表达大鼠特异性树突状细胞标志OX62。
3. 胸腺树突状细胞
小鼠胸腺树突状细胞表达CD11c、CD8α、DEC-205和HSA，不表达CD11b和33D1。大部分胸腺树突状细胞的重要特征是表达CD8αα同二聚体。而人胸腺树突状细胞不表达CD8α。
4. 脾脏树突状细胞
脾脏白髓交错突细胞和边缘区树突状细胞均表达N-418，而白髓的交错突细胞还表达DEC-205，边缘区树突状细胞则表达33D1。在不含钙离子的条件下，用酶消化法可从小鼠脾脏获得相同数量的CD8α+和CD8α- 树突状细胞。其中CD8+树突状细胞表达DEC-205和HSA，不表达CD11b整合素；CD8- DC的表型则相反。
如此，小鼠脾脏可分为两个主要的树突状细胞亚群：CD11c+ 、CD8α+、 DEC205+、HSA+、CD11b-、33D1- 树突状细胞对应于白髓交错突树突状细胞，而CD11C+ CD8α-DEC-205-HSA-CD11b+ 33D1+代表边缘区树突状细胞。交错突树突状细胞表达高水平的MHC-Ⅱ、恒定链分子以及CD40、CD86；边缘区树突状细胞则相对不成熟。需要注意的是，在小鼠脾脏，大部分甚至全部CD8α+ 树突状细胞均表达FAS 配体。
小鼠脾脏单个核细胞悬液在基质细胞培养中，可长期（长达7年）稳定产生具有免疫活性的树突状细胞，表达CD11c、CD11b、DEC-205、 CD80/86 和33D1，而不具有T、B、巨噬细胞和粒细胞标记。
6. 淋巴结树突状细胞
小鼠淋巴结树突状细胞有三个亚群，一是表达CD8α、DEC205、HSA，不表达CD11b的亚群，类似于脾脏的交错突树突状细胞，占树突状细胞的大部分；二是表达CD11b，不表达 CD8α、DEC-205、HSA的亚群，类似于脾脏的边缘区树突状细胞，代表非淋巴组织树突状细胞通过输入淋巴管进入淋巴结被膜下窦的树突状细胞；三是表达DEC-205和HSA，不表达CD8α 和CD11b的亚群，其来源不明。
四、树突状细胞的其他分子表达
1. 与抗原摄取处理和提呈有关的分子
①补体受体
血树突状细胞和郎格罕细胞弱表达补体受体CD11b和CD11c。真皮树突状细胞还表达CD88（C5a受体）；血树突状细胞则又表达CD55、CD59和CD46，可防止血树突状细胞被补体介导的溶解作用而杀伤。
②Fc受体
树突状细胞Fc受体介导细胞特异性摄取调理化的抗原。新鲜分离的异质性血树突状细胞中，分化早期的树突状细胞表达CD32、CD64， 不表达CD16。CD32 和CD64可介导树突状细胞吞噬调理化的牛红细胞。人郎格罕细胞表达CD32 、CD64、高亲和力和低亲和力IgE受体。树突状细胞表面表
第一章 树突状细胞的细胞学基础
第一节 树突状细胞的命名与分类
一、树突状细胞的命名与分布
1973年，美国Rockfeller大学Steinman和Cohn教授首先从小鼠脾脏中分离出一群胞质呈星状突起、核极不规则的细胞，乃命名为树突状细胞（dendritic cells，DC）。此后，Steinman等在1973年至1979年间，对该细胞进行了系列研究，从小鼠树突状细胞的形态、数量和组织分布，小鼠树突状细胞的体内外功能特征，小鼠脾内树突状细胞的识别和分布，到小鼠脾树突状细胞的纯化、表面标志和体外培养，诸多方面做了大量的实验工作，并将研究结果总结成5篇极有价值的研究论著，连续发表于J Exp Med杂志上公诸同好，从而得到了学术界的公认，确立了树突状细胞是一类具有独特形态的新型细胞群体，是一类极强的MHC携带细胞，有强有力的免疫刺激力和抗原提呈能力。顿时，树突状细胞成为一类新型的免疫辅助细胞，令人瞩目。
树突状细胞在体内分布甚广，全身除脑以外，各脏器皆有树突状细胞分布。由于不同部位树突状细胞在发育程度、表型及功能等方面不完全一致，甚至有很大差异，因此，树突状细胞又有不同的命名。树突状细胞主要的分布及其命名如表1-1-1所示。
体内树突状细胞的分布虽然广泛，但数量却极微，为痕量（trace）细胞群体。如在人外周血单个核细胞中，树突状细胞仅占1% 以下；在小鼠脾脏单个核细胞中，树突状细胞量更少，仅占0.2% ~ 0.5%。 如此微量的树突状细胞， 又无特异性的标志，在一般染色中无法加以鉴别，分离更为困难，致使树突状细胞在70年代末被确认后，虽以其强有力的抗原提呈功能引起高度重视，但终因分离培养方法不成熟而给研究带来重重困难，导致一度陷入困境，甚至有些学者对于树突状细胞的研究是否能够深入下去产生了怀疑的态度，乃于80年代中期对树突状细胞的研究转入低谷。直到1992年，Steinman实验室首先建立了用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating-Factor，GM-CSF）从小鼠骨髓中大规模培养制备树突状细胞的方法，此后很快成功地利用GM-CSF加白细胞介素4（Interleukin 4，IL-4）从人外周血单个核细胞，或用GM-CSF加肿瘤坏死因子α（Tumor Neucrosis Factor α，TNF-α）从CD34+造血干细胞中扩增到大量树突状细胞，才使树突状细胞的研究重新进入高潮，并取得突飞猛进的进展。
二、树突状细胞的类型
早期的树突状细胞研究已对分布于不同部位的树突状细胞冠以不同的命名，近年来，随着对不同组织来源树突状细胞功能特点研究的逐步深入以及对树突状细胞的起源、分化发育研究的重大进展，人们发现了树突状细胞发育成熟过程中的迁移特性，进而认识到不同部位的树突状细胞与其所处的分化发育阶段有密切的关系。通过对大量动物和人的体内外实验结果加以总结，学者们提出体内树突状细胞可以主要归为两大类型，即髓系树突状细胞和淋巴系树突状细胞。至于滤泡树突状细胞（FDC），则视为一类特殊类型的树突状细胞。
1．髓系树突状细胞（Myeloid-derived DC）
髓系树突状细胞是研究最早和最广泛的一类树突状细胞，通常所称的树突状细胞，即常规树突状细胞皆指髓系树突状细胞。目前已知髓系树突状细胞起源于骨髓多能造血干细胞，与粒细胞、单核巨噬细胞有共同的前体——髓系前体。体内分布的外周血树突状细胞、交错突细胞、面纱细胞、郎格罕细胞和间质树突状细胞均为髓系树突状细胞的不同分化发育阶段。髓系树突状细胞的强大免疫提呈功能是其它专职抗原提呈细胞所不及的。髓系树突状细胞高表达激活T细胞所需的一系列分子，其激活T细胞的能力是巨噬细胞和B细胞的10 ~ 100倍，回输树突状细胞甚至可以打破经典的新生期小鼠同种移植耐受的诱导生成。更独特的功能是髓系树突状细胞能激活初始型T细胞，因此作为免疫应答的启动者是其它专职抗原提呈细胞所不可替代的。
近来的研究发现，非成熟的髓系树突状细胞可以通过巨胞饮（macropinocytosis）、受体介导的内吞方式（receptor-mediated endocytosis）和吞噬（phagocytosis）三种途径摄入抗原。所谓巨胞饮方式，即细胞膜在细胞骨架作用下形成大的皱褶，然后摄取液体形成巨大的巨胞饮泡（1~3μm）。树突状细胞通过巨胞饮方式非特异、非饱和地摄入大量的可溶性抗原，此强大的液相吞饮能力可部分弥补其缺乏特异性抗原受体的缺点。受体介导的内吞方式则具有高效性、选择性和饱和性的特点，细胞借助细胞膜表面的受体可以有效地捕捉到浓度很低的相应抗原。树突状细胞虽然没有特异性抗原受体，但其表达FcγRⅡ、甘露糖受体（mannose receptors），这些受体能分别有效介导树突状细胞对抗原-抗体复合物、甘露糖/岩藻糖化抗原的摄取。在小鼠树突状细胞，其表达的DEC-205也属于巨噬细胞甘露糖受体家族，能介导糖基化抗原的摄取。吞噬是细胞摄取大颗粒或微生物（0.5μm以上）的一种内吞方式。在树突状细胞发育的某些特定阶段，如从皮肤中新鲜分离的郎格罕细胞体外可以摄取完整的细菌、0.5~3.5μm的溶胶微粒，肝脏等部位的树突状细胞能吞噬大颗粒，但与巨噬细胞强大的吞噬功能有显著的差别。
髓系树突状细胞在成熟过程中，摄取抗原的能力下降，而提呈抗原的能力增强。成熟树突状细胞不仅可以经MHCⅡ类分子途径提呈外源性抗原给T辅助细胞，而且可以经MHCⅠ类分子替代途径提呈抗原肽段给细胞毒性T细胞，后一途径对诱导CTL产生特异性杀伤肿瘤的作用有重要意义。
在外源性抗原的MHCⅡ加工提呈过程中，摄入的抗原被细胞内的内吞系统分解成抗原肽，并转运至一种富含MHCⅡ的多层膜结构—MIIC（major histocompatibility complex class Ⅱ compartmant）中。MIIC可能是抗原肽与MHCⅡ结合的潜在部位。MIIC 呈多泡状，内含多层膜，直径约200~300nm；具有某些溶酶体特性，如微酸性、含β氨基已糖苷酯酶、组织蛋白酶D、溶酶体相关膜蛋白1（lysosome-associated membrane proteins-1，LAMP-1）/CD63，但无酸性磷酸酶和β-葡萄糖苷酯酶，也无晚期内吞体标志6-磷酸甘露糖受体。内吞标记物在接触细胞30~60分钟后能进入MIIC，并与MIIC 中来自内质网的MHCⅡ类分子结合成抗原肽-MHCⅡ复合物，然后迅速表达至细胞膜表面，与周围许多T细胞接触形成多细胞聚合体，从而有效地把抗原决定簇以抗原肽-MHCⅡ类分子复合物的形式提呈给CD4+T辅助细胞，以进一步发挥免疫效应。此外，体外分离的MIIC 还能激活抗原特异性的T杂交瘤细胞。
近年来的研究发现，树突状细胞与其它抗原提呈细胞一样，还可将通过吞噬和巨胞饮方式摄入的外源性抗原以MHCⅠ类分子替代途径加工，提呈的抗原进而被CTL表面的TCR识别，以发挥对靶细胞的特异性杀伤溶解作用。有关MHCⅠ类分子替代途径中对外源性抗原的加工处理机制尚不十分清楚，但目前认为，至少存在两种不同的加工途径。一种途径是，当外源性抗原通过某种机制从内吞系统中逃脱出来，进入胞质途径，即经典的MHCⅠ类分子途径，抗原被胞质中的蛋白酶体（proteasome）降解成8~10个氨基酸短肽，然后通过抗原肽转运体（TAP）依赖机制将抗原肽运输至内质网，在内质网中抗原肽与新合成的MHCⅠ类分子结合形成抗原肽-MHCⅠ复合物，最后通过分泌小泡的方式表达在细胞膜表面以激活CD8+CTL。German用不全消化模式（indigestion model）解释此途径，他认为，如果抗原提呈细胞内吞适量的外源颗粒结合抗原（经脂质体包裹、乳胶微粒交联、铁微粒交联等产生），并能保持胞吞/吞噬系统膜的完整性，抗原提呈细胞即通过MHCⅡ类分子途径对抗原进行加工提呈；一旦抗原提呈细胞内吞过量的外来颗粒结合抗原，吞噬体的“超载”导致不全融合体的产生或吞噬体质膜的破裂，使抗原泄漏到胞质中，便进入经典的内源性抗原MHCⅠ类分子提呈途径。而经巨胞饮方式摄入的可溶性抗原，可以直接进入MHCⅠ类分子替代途径提呈，然提呈颗粒结合抗原比提呈可溶性抗原效率更高。另一种途径是，抗原加工处理是TAP非依赖性的，不依赖于经典的胞质加工机制和内质网/高尔基复合体系统，抗原肽可能在高尔基复合体后的囊泡小区（如吞噬体和吞噬溶酶体）由蛋白酶降解后再与已装配好的MHCⅠ类分子结合，共同表达于细胞表面；或者通过抗原肽回流，使其跨膜回到细胞外，于细胞表面与MHCⅠ类分子结合，最终由CD8+T细胞识别。髓系树突状细胞如此强大的抗原提呈能力在免疫激活和肿瘤免疫中发挥重要的作用。
最近的研究还表明，在未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞同时存在的情况下，能更有效激活CD4+和CD8+T细胞；另加上肿瘤细胞凋亡小体，激活树突状细胞的效率就更明显。这是由于未成熟树突状细胞摄取、加工抗原的功能与成熟树突状细胞提呈抗原、激活T细胞的功能相互协同的结果；加上吞噬肿瘤调亡小体的树突状细胞能促使自身成熟并将抗原提呈给T细胞，进一步激发T细胞增殖，诱导特异性CTL生成，因而提高了抗肿瘤功能。
有关髓系树突状细胞的分化发育、形态特征、分子表达及其与T、B细胞关系等其它细胞学基础，髓系树突状细胞的分离扩增，髓系树突状细胞与肿瘤免疫等方面的研究，将在以后各章节逐一介绍，在此不再赘述。此外，以后各章节介绍的髓系树突状细胞，均通称为树突状细胞。
2．淋巴系树突状细胞（lymphoid-related DC）
淋巴系树突状细胞是起源于骨髓多能造血干细胞的另一类树突状细胞，其前体细胞不同于髓系树突状细胞，而是与T细胞、B细胞和NK细胞有共同的前体——淋巴系前体，均来自淋巴定向干细胞。虽然目前对淋巴系树突状细胞的具体分化发育过程尚不清楚，但是对于淋巴系树突状细胞来源于淋巴系前体这一观点，则已被诸多实验所证实。如在IL-1存在的条件下，体外培养的CD4-、CD8-、SIg-、MHCⅡ+的小鼠胸腺细胞可分化为树突状细胞。将分离的骨髓和胸腺CD4-、CD8-、CD3-、CD44+、CD25+的前体细胞，注射入经γ射线照射的同系小鼠胸腺后，可同时检测到树突状细胞和T细胞的生成。而从人体组织中分离出来的CD4+、CD11b-的T细胞亚群，经过IL-3培养，也可产生具有刺激T细胞作用的树突状细胞。又如，将CD4loT细胞前体静脉注入经亚致死量照射的同基因小鼠，可产生T细胞、B细胞、胸腺树突状细胞和脾树突状细胞，而缺乏髓系和红系细胞的分化。CD19+前B细胞在体外加入IL-1β、IL-3、IL-7、TNF-α、c-kit配体（SCF）和人Flt3配体培养时，可获得具有CD11C、DEC-205、CD80、CD86、MHCⅡ分子的树突状细胞。近年来又发现人类骨髓中存在的CD34+、CD10+、Lin-（无系特异性细胞表面标志的细胞）前体细胞乃T细胞、B细胞、树突状细胞和NK细胞的共同祖先，在胸腺内也存在T细胞、树突状细胞和NK细胞的共同前体，这些前体细胞在骨髓和胸腺微环境作用下，向不同的细胞系分化。
胸腺微环境对诱导骨髓来源的多向潜能干细胞向淋巴系细胞分化起着重要的作用。如小鼠骨髓干细胞在脾内能分化为CD8α+树突状细胞和CD8α- 树突状细胞，CD4loT细胞前体在脾内只能分化为CD8α+树突状细胞；而在胸腺内，无论是骨髓干细胞，还是CD4lo，皆单一分化为CD8α+树突状细胞。目前认为，CD8α+ 树突状细胞是小鼠胸腺树突状细胞的特征性标志，表明在胸腺微环境作用下，骨髓多向潜能的干细胞以同一前体向淋巴系细胞分化。
此外，淋巴系前体细胞的分化还受细胞因子的影响。如小鼠胸腺前体细胞在IL-1α和TNF-α作用下向T细胞系分化；而在IL-3、IL-4、IL-7、TNF-α、Flt3L、SCF和抗CD40抗体等5~7种细胞因子混合作用下，经4天培养却诱导出典型的淋巴系树突状细胞；GM-CSF对小鼠淋巴系树突状细胞的分化发育则无影响，这一点正与髓系树突状细胞的分化发育相反。人胸腺前体细胞分化为树突状细胞系与小鼠所需的细胞因子不完全相同，如从人胸腺中分离出来的CD34+、CD33lo前体细胞，在IL-7、IL-1β、IL-6、GM-CSF、SCF混合培养的条件下，能诱导分化为树突状细胞；而加入IL-2，则同时获得了树突状细胞和NK细胞。有趣的是，作为小鼠胸腺树突状细胞特征性标志的CD8α，在人胸腺树突状细胞却不表达；而在小鼠胸腺树突状细胞呈低水平表达的CD4，在人胸腺树突状细胞却为高水平表达。此类差异的生理意义目前尚不清楚。
成熟的淋巴系树突状细胞主要存在于小鼠和人的胸腺和次级淋巴组织的T细胞区，特别是胸腺内树突状细胞，是用于体外研究淋巴系树突状细胞的主要对象。关于淋巴系树突状细胞的功能特性，目前了解还不多，有待进一步研究。但从现有研究资料来看，已知淋巴系树突状细胞与髓系树突状细胞在功能上差异甚大，髓系树突状细胞的主要功能为加工处理和提呈外源性抗原（包括自身细胞衰老、突变等产生的抗原），而淋巴系树突状细胞主要参与中枢和外周的免疫耐受，在胸腺的淋巴系树突状细胞——胸腺树突状细胞，还是T细胞阴性选择的主要承担细胞。
众所周知，机体有核细胞的表面均有MHC分子，它代表个体的特异性。个体所有细胞表面MHC分子的特异性是完全相同的，而同种异体之间及种属之间的MHC分子皆不相同。MHC分子是淋巴细胞识别自己和异己细胞，以及在自身细胞之间进行免疫协同作用的重要标志。树突状细胞对胸腺细胞的选择及T细胞MHC限制性功能的形成密切相关。
阴性选择是胸腺内发生的T细胞耐受，即自身反应T细胞克隆，通过TCR-肽-MHC复合物的相互作用得以清除的过程。当普通胸腺细胞表面表达CD4、CD8和TCR时，胸腺上皮细胞和胸腺树突状细胞即通过细胞表面的两类MHC分子对胸腺细胞进行严格的阴性选择，只有那些功能与自身MHC特异性相适应的胸腺细胞（2%左右）才能被选择性地留下来并继续发育，其余不适合的细胞均将注定死亡。现认为这种死亡是通过一种自杀机制，即细胞内启动了一种DNA内切酶，使细胞核内的DNA长链全部断裂成许多无用的短链，以致细胞凋亡并被吞噬清除。选择的机理尚未完全明了，但实验已证明胸腺上皮细胞可诱导T细胞克隆的清除。如胸腺皮质上皮细胞可有效处理、提呈抗原给携带有对肽-MHC复合物高亲和力TCR的自身反应皮质DP（double positive）胸腺细胞，诱导此胸腺细胞凋亡。但由于胸腺皮质上皮细胞的抗原提呈功能有限，有人认为胸腺上皮细胞仅可选择性诱导识别内源性合成肽的MHC-Ⅰ限制性胸腺细胞的克隆清除，而对于外来抗原，只有当其在皮质以高浓度存在时，才能发生针对外来抗原的MHCⅡ限制性T细胞在DP阶段被阴性选择。然而，胸腺树突状细胞对抗原的内吞处理潜能及共刺激分子的存在，决定了它可诱导胸腺皮质上皮细胞所不能诱导的T细胞阴性选择。体内外实验均表明，胸腺树突状细胞可诱导针对特异性MHC分子、次要组织相容性抗原、循环蛋白、病毒抗原、病毒或细胞超抗原的T细胞阴性选择。有人发现可溶性的循环抗原更易接近髓质，这提示针对外来抗原的MHCⅡ限制性T细胞的阴性选择主要发生在髓质和皮、髓质交界处。而对胸腺树突状细胞参与阴性选择的分子机制，目前还知之甚少。
至于体内存在的一类特殊类型的树突状细胞——滤泡树突状细胞，其来源至今还存在很大争议。有人鉴于抗原转运细胞（Ag-transproting cells，ATC）向淋巴滤泡的迁移及其与滤泡树突状细胞表型的相似性，而假设ATC为滤泡树突状细胞的前体细胞；有人认为滤泡树突状细胞来源于次级淋巴组织的基质细胞；也有人认为滤泡树突状细胞可来源于初级淋巴组织中的祖细胞。
滤泡树突状细胞缺乏白细胞共同抗原CD45，但表达一些特征性分子，如CD11b、CD21ey、CD35。FDC存在于次级淋巴细胞的B细胞区生发中心，包括脾脏、淋巴结、扁桃体和肠道的Peyer’s结节。在正常机体中，滤泡树突状细胞的主要功能在于维持活化的B细胞活力及B细胞的生长发育。FDC能通过其表面的免疫球蛋白受体（FcR）和补体受体（CR）捕获抗原抗体复合物，这种以免疫复合物形式存在的抗原，能长时间（数月）表达于FDC表面并保持其特有的抗原性，并将抗原加工、提呈给T细胞，因此，滤泡树突状细胞作为外来抗原的储存库能在体内诱导和激发很强的记忆性免疫应答。在此过程中，滤泡树突状细胞不仅能将抗原特异性信号传递给B细胞，还能给B细胞提供非特异性信号，这两种信号对生发中心的形成和二次免疫应答的诱导和维持是非常重要的。
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（张锦堃）
第二节 树突状细胞的分化发育
一、树突状细胞的分化、发育和成熟
90年代以来，大量体外实验研究为人们认识树突状细胞的分化、发育和成熟过程提供了极为有益的资料，至今对髓系树突状细胞的分化发育过程已基本清楚。Austyn将树突状细胞的分化发育过程概括为四个阶段：①树突状细胞的前体；②未成熟期树突状细胞；③迁移期树突状细胞；④成熟期树突状细胞。
1、树突状细胞前体的分化
① 树突状细胞前体的确定
70年代Steinman等提出树突状细胞起源于骨髓，与单核/巨噬细胞有共同的前体。到90年代初期，Reid等人先后采用含有GM-CSF和其它细胞因子的凝集素条件培养基以及含有GM-CSF和TNF-α的无血清培养基，对人骨髓和外周血单个核细胞进行培养，终于首先鉴定出树突状细胞/郎格罕细胞的造血祖细胞克隆，进一步明确了树突状细胞起源于骨髓，并提出人骨髓树突状细胞的前体细胞实际上为CD34+干细胞。此后，大量实验证实了这一观点。例如young等在GM-CSF、TNF-α和c-kit配体的协同作用下，从CD34+前体细胞中诱生出CFU- DC，继而全部分化为的树突状细胞。将其转移到液体培养基后，细胞能活跃运动，伸出面纱样或薄片状的突起，高表达HLA-DR，而缺乏CD14，具有很强的同种异体刺激活性。又如在体外甲基纤维素半固体培养体系中发现，单独应用GM-CSF诱导，CD34+前体细胞只能分化为粒细胞和巨噬细胞，不产生树突状细胞。而将GM-CSF和TNF-α联合应用，则能诱生出两类克隆，一类是典型的CFU-GM，含有粒细胞、巨噬细胞和少量树突状细胞；另一类克隆则全部由树突状细胞组成，即CFU-DC。两类克隆诱生的树突状细胞有相同的特性。这些结果都表明树突状细胞来源于CD34+干细胞，并在机体内存在独立的树突状细胞系（dendritic cell lineage）（图1-2-1）。
进一步的分析表明，人骨髓CD34+干细胞可分化为粒细胞、单核/巨噬细胞和树突状细胞三系细胞克隆的基本规律是，CD34+细胞先分化出CFU-GM，CFU-GM中绝大多数在G-CSF作用下分化、发育为粒细胞（CFU-G），少数在GM-CSF作用下分化为CFU-Mo-DC， CFU-Mo-DC在M-CSF作用下，进一步分化为单核/巨噬细胞（CFU-M）；而在GM-CSF、TNF-α作用下，则进一步分化为CFU-DC，生成树突状细胞前体细胞，并离开骨髓进入外周血（图1-2-2、1-2-3）。
② CD34+前体细胞的分化途径
当CD34+干细胞被确定是树突状细胞的前体后，人们又致力于对CD34+细胞的研究，以探索CD34+细胞向树突状细胞定向分化的途径及其定向分化的发生阶段。
Szabolcs等通过对一种来自骨髓CD34+干细胞的被称为后-CFU双向潜能中间型（post-CFU potential intermediate）细胞的研究，发现在c-kit配体、GM-CSF和TNF-α存在的条件下，post-CFU可进一步分化为树突状细胞；而在没有外源性细胞因子存在，或仅有M-CSF存在时，则发育成巨噬细胞。一旦上述分化完成后，再用细胞因子作用，树突状细胞与单核/巨噬细胞之间便不能相互转化。若将树突状细胞再置于M-CSF中培养，树突状细胞不但不能变为巨噬细胞，反而发生死亡；同样，将巨噬细胞置于GM-CSF和TNF-α中培养，也不能转变成树突状细胞。提示终末分化是不可逆的。
Caux等用人脐血CD34+细胞置于含有c-kit配体、GM-CSF和TNF-α的培养基中诱导5~7天后，发现细胞分为CD14+、c-fms+、CD1a-和CD14-、c-fms-、CD1a+两类亚群。继续培养，CD14+、CD1a-细胞可分化为巨噬细胞或树突状细胞，但这些树突状细胞缺乏Birbeck颗粒；而CD14-、CD1a+细胞则先分化为具有郎格罕细胞特征的细胞，含有Birbeck颗粒，表达Lag抗原和钙粘素E（E-cadherin），至培养12~14天，再进一步分化为成熟的树突状细胞。Strunk等发现从人外周血分离到的CD34+干细胞分为两类，一类是CD34+、CLA+（皮肤淋巴细胞相关抗原）、CD45RA+、CD71lo，另一类是CD34+、CLA-、CD45RAlo、CD71+，两群细胞均可在体外由GM-CSF和TNF-α联合诱导生成树突状细胞，但仅前者可生成含有Birbeck颗粒的郎格罕细胞（图1-2-4）。由此可见，在发育早期，树突状细胞的系统发育定向已被确定。这样，树突状细胞的分化发育过程可归纳为两条定向途径：一是CD34+细胞先分化为CD14-、CD1a+细胞，经过郎格罕细胞阶段，再分化为成熟树突状细胞；一是CD34+细胞先分化为具有双向分化特性的CD14+、CD1a-的中间阶段细胞，然后在M-CSF作用下分化为巨噬细胞，而在GM-CSF和TNF-α作用下分化为成熟树突状细胞，CD14和c-fms也随之丢失（图1-2-5）。
目前认为，两条定向途径发育而来的树突状细胞，均能在体外培养12~14天成熟为具有典型树枝状突起的树突状细胞，表达CD80、CD83、CD86、CD58，也高表达HLA-DR，有强大的激活初始型T细胞的能力和抗原提呈功能，将抗原提呈给T细胞，从而诱导细胞免疫。但两者发育过程的不同又决定了它们在功能上有一定差异，如捕捉抗原的能力、甘露糖受体和非特异性酯酶的表达等。特别引人注意的是，仅有来源于CD14-、CD1a+的树突状细胞才能诱导处女型B细胞在CD40和IL-2作用下分泌IgM，因此，这一来源的树突状细胞可能除了参与细胞免疫以外，也参与体液免疫。
2、未成熟期树突状细胞
树突状细胞分化发育过程中均经过未成熟期树突状细胞阶段。在CD14-、CD1a+定向发育途径中，郎格罕细胞即为未成熟期树突状细胞，主要分布于表皮和粘膜的上皮组织中；而在CD14+、CD1a-定向发育途径中，未成熟期树突状细胞主要分布于非淋巴器官的间质中（除脑以外），也称间质树突状细胞。
未成熟期树突状细胞缺乏几种主要辅助分子，如CD40、CD54、CD58、CD80和CD86，而这些分子正是与树突状细胞抗原提呈作用密切相关的分子，也是与树突状细胞对T细胞的激活作用密切相关的分子，故这类树突状细胞刺激初始型T细胞的能力很弱。但未成熟期树突状细胞表达一些膜受体，如FcγRⅡ、人甘露糖受体或鼠DEC-205分子，这些受体与介导树突状细胞摄入抗原密切相关，同时，这类树突状细胞也能通过巨胞饮和吞噬作用摄取抗原。如用GM-CSF和IL-4体外培养人外周血单个核细胞获得的非成熟树突状细胞能通过巨胞饮持续摄入大量液相标记物LY（lucifer yellow），单个树突状细胞每分钟可摄入50μm3液体。新鲜分离的皮肤郎格罕细胞可摄入细菌和溶胶微粒，但并不能象巨噬细胞那样吞噬红细胞及胶体碳，而且在体外培养72小时后，郎格罕细胞的吞噬功能明显下降。可见，树突状细胞发育过程中，摄取抗原的能力主要表现在未成熟阶段。
未成熟期树突状细胞含有一些重要的细胞器，如内质体（endosome）、MIIC、CIIV和溶酶体等，这些细胞器受到学者的高度重视。如用GM-CSF体外培养小鼠骨髓细胞，在细胞发育早期，即培养的第4~5天，其细胞膜表面几乎不表达MHCⅡ，而在细胞内却含有丰富的MHCⅡ，这些MHCⅡ分布于细胞核周围区域的MIIC 内。继续培养至6~7天，其内的MHCⅡ大部分位于靠近细胞膜表面的外周区域，存在于类似CIIV的小泡中。再培养至8~10天，细胞发育进入晚期，成熟为具有典型形态和表型的成熟树突状细胞，其膜高表达MHCⅡ，而细胞内的MHCⅡ却很少。未成熟期树突状细胞内的MHCⅡ类分子的分布状态类似于发育早期的树突状细胞，此阶段树突状细胞将抗原和新合成的MHCⅡ积聚在MIIC 内有利于抗原加工及抗原肽-MHCⅡ复合物的合成，但新合成的抗原肽-MHCⅡ复合物仍被滞留在MIIC 内，以避免抗原在外周组织中被过早提呈。可见，未成熟期树突状细胞所含的细胞器与MHCⅡ类分子的合成、MHCⅡ类分子与抗原结合以及MHCⅡ类分子的再循环等功能密切相关。此外，这类树突状细胞还能分泌一些趋化因子和具有炎性介质作用的细胞因子，如郎格罕细胞能产生TNF-α、IL-1、IL-6、IL-15等。因此，未成熟期树突状细胞是外周非淋巴组织中处于抗原加工期的树突状细胞。
3、迁移期树突状细胞
未成熟期树突状细胞在体内必须经历一个迁移过程，进入迁移期树突状细胞阶段。迁移期树突状细胞主要存在于输入淋巴管、外周血、肝脏血液和淋巴组织，通过淋巴管和/或血循环迁移，最终到达周围淋巴器官。树突状细胞的迁移过程是树突状细胞发育成熟的重要过程，也是树突状细胞摄取抗原能力逐渐下降、抗原提呈功能逐步增强的重要过程，而趋化因子/趋化因子受体系统在这一过程中起着十分重要的作用。
树突状细胞表达多种趋化因子受体，受趋化因子趋化。趋化因子受体属于G蛋白偶联受体超家族，在胞内区与G蛋白偶联，参与信号传导。当信号从受体传至G蛋白时，细胞内产生第二信号，于是细胞骨架重新组合，细胞局部粘附形成，并通过伪足的延伸和缩短使细胞与周围介质发生粘附或脱离，最终使细胞发生定向迁移。在树突状细胞分化发育过程中，其趋化因子受体的表达谱会发生一些改变，因此不同发育阶段的树突状细胞对不同趋化因子的反应性不同。在正常情况下，体内绝大多数树突状细胞处于未成熟阶段，未成熟树突状细胞表达高水平CCR1、CCR2、CCR5、CXCR1、CXCR2和CXCR4等趋化因子受体，对CC趋化因子包括MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MCP-3有明显的趋化反应性，但对CC趋化因子MIP-3β和CXC趋化因子SDF-1α反应性较弱。这些CC趋化因子能诱导未成熟树突状细胞向外周组织迁移，使之接触并接受抗原刺激信号，然后继续向成熟树突状细胞方向发育。
4、成熟期树突状细胞
最近研究表明，迁移期树突状细胞在接受某些刺激因子或抗原（如LPS、TNF-α、IL-1β）刺激后，其原先于未成熟期存在的对CC趋化因子的反应性基本丧失，相反，对原先反应较弱的MIP-3β和SDF-1α（基质细胞来源的趋化因子）的反应性却明显升高，与这些反应性相关的趋化因子受体CCR5表达减低而CXCR4表达增多。日本学者还发现，成熟树突状细胞选择性地表达CCR7，其配基ELC/MIP-3β可选择性地诱导成熟树突状细胞迁移（而对未成熟树突状细胞无此作用），即诱导表达CCR7并已携带抗原信息的成熟树突状细胞从外周组织（如炎性部位）迁移至淋巴器官，归巢至T细胞区。在与静息T细胞接触后，树突状细胞获得进一步的分化成熟信号，使其成为功能上完全成熟的树突状细胞，从而激发T细胞免疫反应。
二、CD34+前体细胞发育为髓系树突状细胞的替代途径
在髓系树突状细胞分化发育的研究中，除了直接采用分离纯化的CD34+干细胞外，还常用人外周血单核细胞、小鼠脾脏单个核细胞等，也能诱导分化出功能成熟的树突状细胞。可见，CD34+干细胞分化发育为树突状细胞尚存在替代途径。
1、单核细胞分化为树突状细胞
单核细胞向树突状细胞分化与CD34+干细胞向树突状细胞分化有密切关系。在CD34+干细胞向树突状细胞分化过程中，曾出现向树突状细胞和巨噬细胞双向分化潜能的CD14+、CD1a-细胞，因此，有学者提出，在这一系统发育过程中，CD14+前体分化而来的单核细胞可能还保持双向分化潜能，乃试图由单核细胞直接诱生树突状细胞。目前，这一推论已成为事实。
实验证明，GM-CSF与IL-4或IL-3联合应用，皆能诱导人外周血单核细胞分化为树突状细胞，但所诱生的树突状细胞在形态、表型和功能方面都表现为未成熟型细胞的特点，如表达CD1a、RelB，低表达CD80、CD86和CD58，同时也表达单核细胞的标志CD11b、CD36、CD68及c-fms，不表达树突状细胞终末成熟的标志CD83和p55（55 kd Actin-Bundling Protein）。这类树突状细胞的胞质内出现MIIC，在功能上能通过受体的介导有效地摄取抗原，也有吞噬作用，但刺激初始型T细胞的功能很弱。培养基中加入胎牛血清较加入人血清或血浆诱生树突状细胞的能力稍强，但在去除细胞因子后，上述细胞均失去树突状细胞的特征；反之，若给以一定的刺激信号，这些细胞就继续分化成熟并表现出成熟树突状细胞的特征，包括细胞的树突状形态、高表达辅助分子CD80、CD86和CD58等，而失去单核细胞的标志，在功能上能将MHCⅡ类分子转运到细胞表面并能启动初始型T细胞反应，但失去摄取抗原的能力。促使这类树突状细胞成熟的因子有多种，如TNF-α可诱导GM-CSF和IL-4胎牛血清培养的树突状细胞终末分化。在单核细胞条件培养基中，不必加入胎牛血清，用GM-CSF和IL-4诱导7天，也可促使树突状细胞终末分化，这可能是单核细胞条件培养基中存在着某些使树突状细胞不可逆终末分化所必需的因子。Odeherty等在长时间的研究中发现，单核细胞培养基中的TNF-α、IL-1β、IL-6和INF-α起了重要的作用。若只是这些因子联合应用或各自单独应用，均不能完全代替单核细胞条件培养基。Akagawa 等研究表明，单核细胞受M-CSF作用向巨噬细胞分化，或受GM-CSF作用向树突状细胞分化，都是可逆的；然而，加上TNF-α，则使单核细胞上的M-CSF受体丢失，使单核细胞向树突状细胞的分化变为不可逆。Paluck等研究也证明了这一点，并认为单核细胞是树突状细胞和巨噬细胞的共同前体，而成熟树突状细胞则为单核细胞分化后的终末期细胞。炎性刺激因子LPS、前列腺素等也能诱导树突状细胞的终末成熟，是通过CD40L-CD40的作用来完成的。Trance等还发现，由T细胞提供某些TNF超家族成员的信号，如CD40L，也能促进树突状细胞终末分化，并促进其功能成熟（图1-2-6）。此外，在促进单核细胞诱生树突状细胞的细胞因子中，以IL-13代替IL-4，即GM-CSF与IL-13联合应用，也可获得同样的效果。
然而，体内单核细胞是否能不断进入组织并自动分化发育为树突状细胞，或受炎性刺激而分化发育为树突状细胞呢？若果真能如此，则更有利于将其应用于临床而使之发挥与原代树突状细胞相类似的作用，因此，这是目前的研究焦点之一。Barratt-Boyes等将黑猩猩的单核细胞分离出来并经GM-CSF和IL-4联合培养诱导产生的树突状细胞，通过静脉回输至体内后，发现很多细胞归巢至淋巴结T细胞区。但至今尚未见这类细胞归巢至脾脏的报道。关于单核细胞在体内如何转化为树突状细胞，Andolph认为，当单核细胞穿过内皮细胞从组织进入淋巴时，单核细胞通过与内皮细胞间相互作用而分化为未成熟树突状细胞，淋巴中的面纱细胞可能就是这类树突状细胞。若单核细胞吞噬了颗粒，经内皮返回淋巴管时，这类细胞仅仅需要48小时，而不是8~10天，便可分化为树突状细胞，这些树突状细胞具有MIIC所具有的溶酶体相关膜蛋白LAMP标志和p55标志；这类树突状细胞进一步分化成熟，可高表达MHCⅡ和CD86，但不表达单核细胞的标志，如CD14、CD32和CD64。但在生理状况下单核细胞向树突状细胞分化的问题，尚待进一步研究。
2、脾细胞来源的树突状细胞
在开展树突状细胞研究的早期，树突状细胞的主要来源就是从脾单个核细胞分离而来。脾细胞分离的树突状细胞得率较低，一般处于其发育的某一阶段，尚未完全成熟，但只需在体外给予一定的刺激信号或细胞因子，如LPS、TNF-α、IL-1β等，就能使其很快进入成熟期。因此，脾细胞来源的树突状细胞虽不利于用以对其分化发育的研究，也不利于用来开展过继回输免疫治疗实验，但用于研究影响树突状细胞成熟的因素有一定价值，而对于研究树突状细胞的生物学特性和功能则有更高的价值。
三、细胞因子在树突状细胞分化发育中的作用
在树突状细胞的分化发育过程中，细胞因子起着重要的调节作用。有些细胞因子，对树突状细胞的分化发育起促进作用。自90年代以来，正是利用这些细胞因子的作用，从体外扩增培养出大量的树突状细胞。但是，也有一些细胞因子对树突状细胞的分化发育起抑制作用，如IL-10，是一种具有免疫抑制特性的细胞因子（图1-2-7）。IL-10能阻止GM-CSF和IL-4联合诱导的人外周血单个核细胞向树突状细胞分化，抑制经LPS刺激的树突状细胞向成熟分化，也能于体内抑制外周炎症刺激因子诱导树突状细胞成熟。IL-10又能有效抑制树突状细胞表面经CD40诱导IL-12的生成，还可直接下调外周血树突状细胞表面B7-1、B7-2、ICAM-1和MHCⅡ类分子的表达。其中B7-2分子的表达下调后，导致CD28/CTLA-4的结合位点减少，从而抑制这些树突状细胞对静止期T细胞的刺激能力，乃至抑制增殖反应及T细胞产生IL-2和IFN-γ的能力。可见，不同的细胞因子在树突状细胞的分化发育中起着不同的作用，在此我们选择一些应用于体外扩增培养树突状细胞的细胞因子加以描述。
1、常用的细胞因子
目前，最常用的细胞因子是GM-CSF、TNF-α和IL-4等，通过联合应用GM-CSF和TNF-α诱导CD34+干细胞向树突状细胞分化，而联合应用GM-CSF和IL-4诱导单核细胞向树突状细胞分化。在上述基本因子作用下，为进一步促进树突状细胞的分化发育，也加用一些其它细胞因子，如干细胞增殖分化的早期细胞因子SCF等。
GM-CSF不仅能诱导一系列特征性启动因子（start factor）的表达以启动树突状细胞的分化，促进MHCⅡ-树突状细胞干细胞群、MHCⅡ+树突状细胞干细胞群和未成熟树突状细胞发育，而且还能上调树突状细胞表达CD86，使成熟树突状细胞活化，在树突状细胞的分化发育中起着关键性的作用。TNF-α也是树突状细胞早期发育乃至整个发育过程中所需的细胞因子，TNF-α在树突状细胞终末分化中的关键作用不容忽视。如体外分化发育的小鼠骨髓树突状细胞，在最后两天的成熟阶段，TNF-α对树突状细胞的成熟有明显的促进作用。在单核细胞衍生树突状细胞的发育过程中，具有双向分化潜能的单核细胞在GM-CSF作用过程中加入TNF-α，使单核细胞丢失M-CSF受体，向树突状细胞分化则变为不可逆。GM-CSF与TNF-α联合应用还进一步发挥了二者的协同作用，TNF-α作为第一信号，上调树突状细胞前体的GM-CSF受体，使其达到一定的阈值，以接受GM-CSF的刺激，引导前体细胞向树突状细胞分化；在整个树突状细胞发育阶段，TNF-α能维持树突状细胞的GM-CSF受体的高水平，保证了GM-CSF作用的充分发挥。IL-4对巨噬细胞生长有抑制作用，因此IL-4与GM-CSF协同作用可促使CD14+细胞向树突状细胞方向分化，并能增强未成熟树突状细胞摄取抗原的作用，从而促使其发育成熟。
最近的研究表明，IL-3与TNF-α协同作用可诱导CD34+干细胞向树突状细胞分化，CD40L也可诱导GM-CSF依赖性树突状细胞的分化发育；体内实验也表明，输入Flt3L可促使淋巴器官中成熟树突状细胞数量明显增多。如此看来，GM-CSF并非是完全不可替代的。
2、其它细胞因子
① TNF家族的其它成员
TNF家族中的一些细胞因子可以替代或增强TNF-α的功能，近年来受到高度重视的CD40就是其中之一。CD40/CD40L结合后，启动了树突状细胞的成熟过程，促使树突状细胞发生重要的、向成熟细胞方向发展的形态学变化，诸如胞质减少、树枝状形态增多、表型改变等，特别是保持树突状细胞 MHCⅡ类分子的高水平表达，上调CD80、CD86、CD58等辅助分子的表达。当树突状细胞表面MHC-抗原肽与T细胞TCR/CD3结合后，CD40/CD40L的结合又使树突状细胞表面的CD80、CD86表达进一步增加，并与配体CD28、CTLA4结合，为T细胞活化提供共刺激信号。CD40/CD40L结合还可以刺激CD34+干细胞进入DNA合成期，引起CD34+干细胞增殖，这一作用是CD40特异性的，因为它能被Anti-CD40单抗及Anti-CD40L单抗所阻断。CD40/CD40L也可诱导CD34+干细胞分化为树突状细胞，这类树突状细胞不表达CD10和CD40，但表达CD26，高表达转换激活因子rel-B，刺激T细胞的功能也较弱。CD40/CD40L的作用不依赖于GM-CSF，而GM-CSF对树突状细胞的作用更强，是CD40/CD40L的2倍。
最近，又发现TNF家族的另一个成员——TRANCE能上调Bel-XL的表达，成熟树突状细胞高表达TRANCE受体，当其与TRANCE结合后，能通过抑制树突状细胞凋亡来延长树突状细胞的寿命，维持对T细胞的持续刺激力。
② IL-3和IL-13
IL-3与GM-CSF有交叉作用，IL-13则与IL-4有交叉作用。IL-3能协同TNF-α促进脐血CD34+干细胞向树突状细胞分化，与GM-CSF作用相似。IL-3似乎可以替代GM-CSF的功能，这也可以解释GM-CSF缺陷小鼠为何能维持正常造血功能和有正常的脾树突状细胞。在外周血单个核细胞分化为树突状细胞时，IL-13又可替代IL-4的作用。
③ Flt3配体
Flt3配体（FL）是酪氨酸激酶受体的配体，近年来发现Flt3配体与c-kit配体相似，在树突状细胞的分化发育中起促进作用（图1-2-7）。如在GM-CSF与TNF-α联合诱导CD34+干细胞向树突状细胞分化的培养基中，追加Flt3配体后，Flt3配体可与CD34+细胞表面的Flt3特异性结合，进一步促进细胞增殖。Flt3配体与Flt3结合后，还能显著延长造血干细胞在无血清培养基中存活的时间，有利于纯化的脐血造血干细胞或前体细胞的短期储存、处理和运输。体内实验表明，Flt3配体可促使小鼠体内树突状细胞大量增加，也可促进健康人外周血树突状细胞大量增加，其扩增量高达30倍。然而，在培养体系中单独或联合应用Flt3配体和c-kit配体，均不能改变CD34+细胞来源的树突状细胞表型，可见Flt3配体与c-kit配体的作用相似，只能促使树突状细胞扩增，而不能诱导树突状细胞分化。
④ TGF-β1
TGF-β1是又一种重要的细胞因子。Strobl等发现CD34+干细胞分化为CD1a+、Lag+，含Birbeck颗粒的郎格罕细胞，除需要GM-CSF和TNF-α外，还需要TGF-β1和c-kit配体；而用Flt3配体介导的郎格罕细胞的发育也需要TGF-β1的支持。Flt3配体与c-kit配体都是通过为TGF-β1提供向郎格罕细胞分化的关键信号而促使CD34+细胞分化为郎格罕细胞，因此，TGF-β1是郎格罕细胞分化的必需因子（图1-2-7）。
此外，IL-1能增强GM-CSF促进树突状细胞成熟的功能，并能促进树突状细胞与T细胞结合，增强成熟树突状细胞的抗原提呈功能和激活初始型T细胞的作用。
四、树突状细胞的寿命
在体外，树突状细胞的存活依靠细胞因子和刺激分子来维持，当上述因子缺乏时，树突状细胞一般只能存活数天，甚至迅速死亡；分离的小鼠脾树突状细胞存活时间较长，可达十余天，但细胞活力在存活过程中明显减弱。而在GM-CSF存在的条件下，可维持数周至三个月。在体内，根据实验方法、种属和器官等不同，树突状细胞寿命自3天至4周不等，而在皮肤可能较长。树突状细胞在摄取抗原后，其提呈能力可维持数天。但对树突状细胞在完成抗原提呈功能活化T细胞以后，其命运又当如何，目前知之甚少。最近研究表明，淋巴结内的成熟树突状细胞在提呈抗原后，自身很快出现凋亡。目前已知成熟树突状细胞高表达TRANCE受体，而TRANCE可通过上调Bel-XL表达而抑制树突状细胞凋亡，能延长成熟树突状细胞的存活期。然而，有关如何防止树突状细胞死亡，树突状细胞死亡时发生什么变化等问题，尚有待进一步探讨。
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（张锦堃）
第三节 树突状细胞的形态特征
树突状细胞在分化发育过程中，其形态结构也发生相应的改变。本节着重介绍成熟树突状细胞的结构特点，简述树突状细胞在体外生长过程中的形态变化。
一、成熟树突状细胞的形态特征
1、光镜下形态
① 树突状细胞的活细胞形态
倒置相差镜下，树突状细胞悬浮生长，大小不等，形态极不规则，向四周伸出不同数量的粗细不一、形态迥异的胞质突起，有的短而粗，末端呈钝圆的伪足样；有的细而长，形成许多参差不齐的多分支的树枝状，表面呈毛刺样；也有的两者兼有。细胞突起在培养液中不停地摆动或迅速持续地伸缩，致使其方向和形态不断地改变。核大而不规则，常呈扭曲状，有折光和明显搏动。胞质内有致密颗粒，为线粒体；偶有折光性强的脂滴存在。（图1-3-1,1-3-2）。若悬液中存在淋巴细胞或淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine-activated Killer，LAK），则可见树突状细胞周围有淋巴细胞（L）或LAK细胞聚集现象，少则2~3个细胞，多则4~25个细胞，分别形成DC-L或DC-LAK细胞簇。两者比较，DC-LAK较DC-L形成的细胞簇较大，聚集的细胞较多。
② 涂片中树突状细胞的形态
树突状细胞涂片用常规方法染色，在形态上与单核巨噬细胞不易区分，用细胞化学法染色也不易清晰地显示树突状细胞的全貌。如在PAS反应中，树突状细胞呈阴性反应，在碱性磷酸酶（ALPase）、腺苷三磷酸酶（ATPase）和过氧化物酶（Poase）反应中，树突状细胞也呈阴性。在酸性磷酸酶（AcPase）反应中表现不一，可为阴性，也可在核凹陷处有大圆点状的黑色反应产物，或在核附近有数个细小的黑色反应颗粒。在普鲁士蓝（Prussian blue）反应中，细胞膜表面附有许多蓝绿色铁微粒，而细胞质呈阴性反应。因此，采用与单核巨噬细胞有鉴别意义的多抗，如S-100蛋白，或采用与树突状细胞的表面分子相对应的单抗，如Ia、HLA-ABC、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD54、CD80、CD86、CD83等等作为一抗，进行免疫细胞化学或免疫荧光染色，则可借助阳性反应的结果清晰地显示出树突状细胞的形态。
涂片中呈阳性反应的树突状细胞，其胞体大而多突起，突起的数量和形态各异。突起和胞质内充满阳性反应产物，在免疫细胞化学反应中，显示出与显色剂颜色相应的弥散或细颗粒状的阳性反应产物，如用DAB显色，可显示棕黄色；在免疫荧光反应中，则发出与荧光剂色彩相应的强荧光，如用FITC标记，可显示黄绿色荧光（图1-3-3）。细胞核也大而极不规则，时有扭曲。在悬液涂片中，还常见树突状细胞借助细长的突起相互接触，或见数个树突状细胞聚集成群。若悬液中存在淋巴细胞，也可见树突状细胞与淋巴细胞形成花环，花环中央为呈阳性反应的树突状细胞，其周围围绕着淋巴细胞（图1-3-4）。
③ 切片中树突状细胞的形态
在淋巴结和脾脏的石蜡切片或冰冻切片中，应用相应的免疫组织化学染色法，均可见呈阳性反应的树突状细胞。在淋巴结中，树突状细胞位于副皮质区，多为散在分布，也可呈小片状或小索状分布；在脾内，树突状细胞位于白髓动脉周围淋巴鞘内，以鞘的中外层为多，单个散在分布。切片中树突状细胞胞体较大，胞质较多，而突起较短而钝，胞质和突起内也充满弥散或颗粒状的阳性反应产物，核的形态不一，这些都与切面有关。单个存在的树突状细胞也常与周围的淋巴细胞结合形成花环。石蜡切片与冰冻切片中的树突状细胞形态无明显差异。
2、电镜下形态
① 扫描电镜下树突状细胞的形态
在细胞悬液中，被固定的树突状细胞仍保持其特征性的突起，使细胞呈星状、多角形或极不规则形。突起长短不一，分支形成1~4级的亚突起。突起的形态差异更大，有细长针刺样突起，有鳞茎状、花瓣状、钝圆伪足状突起，也有船帆状薄片样突起，薄片甚至可长达数微米。同一细胞可兼有不同形态的突起。树突状细胞的胞体和突起表面光滑，无明显小棘、皱褶或微绒毛（图1-3-5~1-3-10）。在悬液中有淋巴细胞存在时，树突状细胞同样与淋巴细胞聚集成簇。
② 透射电镜下树突状细胞的形态
超簿切片中的悬液树突状细胞，其胞体、突起和核因切面关系形态显得更为复杂，但细胞表面光滑，没有微绒毛。突起则呈多样化，有的呈丘状隆起，有的呈粗短指状，有的呈伪足样，有的弯弯曲曲，有的细而长，可向四周呈放射状伸出，也可盘曲呈环状，甚至有折叠现象。细胞核极度不规则，有时被切成互不相连的数块，常偏位，薄层异染质附于核膜下，偶见核仁。胞质量不等，一般电子密度较低，细胞器不发达，特别是溶酶体和吞噬体，或仅在核附近少量存在，或完全缺如；但有中等量核糖体和线粒体，线粒体多呈圆形或椭圆形，常成群存在，线粒体嵴较发达。（图1-3-11~1-3-14）。
二、树突状细胞前体在体外分化发育中的形态变化
倒置相差镜下，CD34+细胞呈圆形，胞体小，在培养液中悬浮生长。CD34+细胞受相应细胞因子诱导，在向树突状细胞分化发育的过程中，细胞体积逐渐增大，细胞形态逐渐从圆形变为梭形、逗点状、蝌蚪状、星形或不规则形。在生长过程中，单个散在的细胞逐渐聚集成簇状细胞集落。开始集落较小，由3~5个细胞组成；以后集落逐渐增大，可达10个以上细胞。集落边缘呈毛刺状，周围有形态典型的树突状细胞脱落。继续培养，细胞脱落增多，集落变小，集落数量也逐渐减少。脱落的细胞多为成熟树突状细胞，突起形态多样，有的短而粗，有的细而长、也有的多分支，但表面仍呈毛刺样；细胞核常扭曲，搏动明显。成熟树突状细胞在悬液中的活动甚为活跃（图1-3-15、1-3-16）。
电镜下，树突状细胞在分化发育过程中除形态相应改变外，最大的特点是经郎格罕细胞分化阶段发育而来的树突状细胞，在郎格罕细胞阶段，胞质内出现Birbeck颗粒，而进一步发育成熟，Birbeck颗粒也随之消失。Birbeck颗粒又名郎格罕细胞颗粒，该颗粒有界膜包被，呈扁盘状或星形，一端可有突出的球形泡。颗粒长15~30nm，宽约4nm，颗粒的纵切面呈杆状或网球拍形，杆的中央有纵向的致密线，其上有6nm周期的横纹。对于Birbeck颗粒的来源，看法尚不一致，有人认为是由细胞质膜内陷形成，有人则认为是高尔基复合体发生的泡形成。至于Birbeck颗粒的功能，目前知之不多，可能为消化细胞外物质的吞噬体，也可能是向细胞外释放某种物质的结构。在郎格罕细胞，则可能与摄取抗原的功能有关。
树突状细胞前体在体外分化发育过程中，另一形态学特征是细胞表面分子随着不同发育阶段发生相应的改变，这将在下一节“树突状细胞的分子表达”中详细描述。
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（张锦堃）
第四节 树突状细胞的分子表达
树突状细胞的分子表达非常复杂，不同种系、不同组织、不同类型的树突状细胞，有不同的分子表达；同一树突状细胞处于不同的分化发育阶段，有不同的分子表达；即使分化成熟的树突状细胞，其所处的功能状态的不同（如静止状态和被激活状态），还是有不同的分子表达。因此，树突状细胞的分子表达与其分化发育功能的关系一直为人们所关注，而进一步寻找树突状细胞特异性的分子表达更是树突状细胞的研究热点之一。
一、常用的树突状细胞的识别标志
目前有少数物种的某几个树突状细胞亚群的特异性或相对特异性表面分子得到确认，并用以作为识别这些树突状细胞亚群的标志。
1．小鼠树突状细胞
① 33D1：是小鼠脾脏树突状细胞一个亚群的特异性标志，33D1单抗是Steinman最早制备成功的一种小鼠脾脏树突状细胞的识别单抗。
② NLDC-145（DEC-205）：表达于小鼠脾脏树突状细胞另一个亚群上，也表达于淋巴结、胸腺等淋巴器官T细胞区的树突状细胞上，但胸腺皮质上皮以及激活的巨噬细胞也表达这一标记。DEC-205抗原的cDNA已被克隆，其编码的分子与巨噬细胞甘露糖受体有关。
③N418（CD11c）：小鼠树突状细胞高表达N418，包括小鼠脾脏树突状细胞的两个亚群，但激活的巨噬细胞也表达这一标记。
2．大鼠树突状细胞
OX62：大鼠树突状细胞高表达OX62，OX62单抗是大鼠脾脏树突状细胞的特异性识别单抗。
3．人树突状细胞
① CD1a：来源于骨髓、经CD14-/CD1a+ 中间阶段分化为郎格罕细胞，再进一步分化为树突状细胞的一个亚群，特异性表达CD1a。CD1a也是郎格罕细胞的识别标志。
② CD83：CD83在激活的人树突状细胞和体外培养的人树突状细胞均有表达，而在人体内生理性存在的树突状细胞和体外新鲜分离的树突状细胞则不表达，因而CD83被认为是树突状细胞充分成熟的标志。CD83功能不明，在小鼠中也未发现类似的表型。
③ CMRF-44：CMRF-44高表达于培养的人外周血树突状细胞上，但一小部分新鲜分离的人外周血树突状细胞和郎格罕细胞上也有表达，因而推测后者为部分分化/激活的树突状细胞亚群。目前，已应用CMRF-44单抗阳性选择这一树突状细胞亚群。然而，接受高剂量IFN-γ治疗患者，其体内的B细胞、单核细胞和巨噬细胞上也能低表达CMRF-44。
④ CMRF-56：CMRF-56是表达于培养的人外周血树突状细胞上的另一分化/激活标记，应用单克隆抗体双标记染色，发现CMRF-56与CMRF-44及CD83有明显不同。
⑤ Lag： Lag分子是郎格罕细胞表面另一特征性分子，其识别单抗是Lag单抗。
⑥ S-100：S-100蛋白虽然不是树突状细胞所特有的标记，但在人外周血及病理切片中，树突状细胞的形态最易与单核/巨噬细胞混淆，单核/巨噬细胞恰好不表达S-100蛋白，因此也常用S-100蛋白作为鉴别树突状细胞的标记。
然而，不同种系、不同组织来源的树突状细胞也有共同的特征：①组成性（constitutive）高表达MHC-Ⅱ类分子；②在成熟树突状细胞，高表达CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD40和CD54（ICAM-1）分子，在不成熟树突状细胞则低表达甚至不表达。因此上述分子也常用作为树突状细胞的识别标志。
二、树突状细胞体外发育阶段的主要分子表达
体外经GM-CSF诱导培养8天的小鼠骨髓单个核细胞悬液，不再表达早期前体细胞的标记CD34和CD31，并生成不同发育阶段的树突状细胞亚群。其中发育成熟的树突状细胞高表达MHC-Ⅰ、 IN-1（细胞内恒定链分子），共刺激分子CD80、CD86、CD40、CD54和中度的CD24，也表达树突状细胞NLDC-145 、CD25 （IL-2Rα）、2A1、M342 和MIDC-8。非成熟的MHC-Ⅱlow 亚群表达CD11c（N418）和CD13。单核/巨噬细胞的标记CD68（macrosialin）、CD11b（MAC-1）、CD14、 LY-6G（Gr-1）的表达随树突状细胞的发育成熟而逐渐减少。LY-6C和ER-MP58在成熟过程中逐渐消失。但F4/80和CD16可持续低表达，TNF-R p75在整个培养过程持续表达，而3D6（sialoadhesin）则始终呈阴性。
三、不同组织树突状细胞的分子表达
1. 人血树突状细胞
新鲜分离的 HLA-DR+CMRF-44+ 细胞表达CD54、CD11b、CD13、CD33和CD4，不表达CD83，为非成熟树突状细胞。经体外培养可进一步分化，发育为表达CD83、CD40、CD80、CD86， 而CD13表达下调的成熟树突状细胞。用HLA-DR++CMRF-44++分选可得到成熟的树突状细胞，表达CD83、CD40、CD86、CD80、CD1b、CD13、CD33、CD4和CD25。
M-DC8是用去T、B、Mo的人外周血单个核细胞免疫小鼠获得的单克隆抗体，外周血白细胞大约含有0.5-1% 的M-DC8阳性的细胞，用磁珠化M-DC8分离外周血，可获得97% 纯度的细胞，它们缺乏单核细胞标记CD14，B细胞标记CD19，T细胞标记CD2，NK细胞标记CD56， P55和CD83也呈阴性，而特异表达CD16（FcγⅢ）和CD64（ FcγⅠ），同时表达CD11c、CD45RA、CD54、CD86、和HLA-A、B、C 。经过36小时的短期培养，CD16转为阴性，而CD40、CD54、CD86、HLA-A、B、C、和HLA-DR等表达升高。
人CD14dim、CD33dim细胞为树突状细胞前体，而CD14dim、CD33bright则为进一步分化的树突状细胞，表达CD5、CD4、HLA-DR、HLA-DQ、CD58（LFA-3）、ICAM-1（CD54）和ICAM-2（CD102），不表达B7分子，经36小时的体外培养后，可上调辅助分子的表达，CD80、CD86的表达也升高。
2. 非淋巴组织的树突状细胞
非淋巴组织的树突状细胞可摄取处理抗原，产生MHC抗原肽复合物并表达于细胞表面，这些树突状细胞称为非成熟树突状细胞或抗原处理树突状细胞。它们分布于皮肤表皮以及呼吸道、胃肠道和泌尿道的粘膜，也存在于心和肾的间质中。一般从非淋巴组织分离的树突状细胞几乎不表达共刺激分子如CD40、CD80和CD86，体外刺激初始型T细胞的能力也很微弱。
新鲜分离的皮肤郎格罕细胞含有birbeck颗粒，表达CD1a、 CD1c、HLA-DR、HLA –DP和HLA -DQ分子，也弱表达或中度表达RFD1、 C3biR、FcγR、p150/95和HLA-A、B、C ，粘附分子 LFA-3 和ICAM-1，但不表达LFA-1和单核/巨噬细胞标记。 经体外培养后，Birbeck 颗粒、 C3biR、 FcγR 及p150/95 完全丢失，CD1a 和 CD1c显著减少或丢失，MHC-II 及 ICAM-1 表达如常，LFA-3 和MHC-I则显著升高，最显著的变化是表达交错突细胞的标记RFD1。而酶活性如ATP酶和非特异性酯酶活性不变，始终不表达单核/巨噬细胞的标记。
大鼠肝脏淋巴结切除术后经淋巴管重建，使肝脏淋巴液直接通过胸导管输出，并引流胸导管收获肝脏淋巴中的树突状细胞。16小时引流可获取5×105 非T、非B、MHC-Ⅱ+ 细胞，其中80% 的细胞表达大鼠特异性树突状细胞标志OX62。
3. 胸腺树突状细胞
小鼠胸腺树突状细胞表达CD11c、CD8α、DEC-205和HSA，不表达CD11b和33D1。大部分胸腺树突状细胞的重要特征是表达CD8αα同二聚体。而人胸腺树突状细胞不表达CD8α。
4. 脾脏树突状细胞
脾脏白髓交错突细胞和边缘区树突状细胞均表达N-418，而白髓的交错突细胞还表达DEC-205，边缘区树突状细胞则表达33D1。在不含钙离子的条件下，用酶消化法可从小鼠脾脏获得相同数量的CD8α+和CD8α- 树突状细胞。其中CD8+树突状细胞表达DEC-205和HSA，不表达CD11b整合素；CD8- DC的表型则相反。
如此，小鼠脾脏可分为两个主要的树突状细胞亚群：CD11c+ 、CD8α+、 DEC205+、HSA+、CD11b-、33D1- 树突状细胞对应于白髓交错突树突状细胞，而CD11C+ CD8α-DEC-205-HSA-CD11b+ 33D1+代表边缘区树突状细胞。交错突树突状细胞表达高水平的MHC-Ⅱ、恒定链分子以及CD40、CD86；边缘区树突状细胞则相对不成熟。需要注意的是，在小鼠脾脏，大部分甚至全部CD8α+ 树突状细胞均表达FAS 配体。
小鼠脾脏单个核细胞悬液在基质细胞培养中，可长期（长达7年）稳定产生具有免疫活性的树突状细胞，表达CD11c、CD11b、DEC-205、 CD80/86 和33D1，而不具有T、B、巨噬细胞和粒细胞标记。
6. 淋巴结树突状细胞
小鼠淋巴结树突状细胞有三个亚群，一是表达CD8α、DEC205、HSA，不表达CD11b的亚群，类似于脾脏的交错突树突状细胞，占树突状细胞的大部分；二是表达CD11b，不表达 CD8α、DEC-205、HSA的亚群，类似于脾脏的边缘区树突状细胞，代表非淋巴组织树突状细胞通过输入淋巴管进入淋巴结被膜下窦的树突状细胞；三是表达DEC-205和HSA，不表达CD8α 和CD11b的亚群，其来源不明。
四、树突状细胞的其他分子表达
1. 与抗原摄取处理和提呈有关的分子
①补体受体
血树突状细胞和郎格罕细胞弱表达补体受体CD11b和CD11c。真皮树突状细胞还表达CD88（C5a受体）；血树突状细胞则又表达CD55、CD59和CD46，可防止血树突状细胞被补体介导的溶解作用而杀伤。
②Fc受体
树突状细胞Fc受体介导细胞特异性摄取调理化的抗原。新鲜分离的异质性血树突状细胞中，分化早期的树突状细胞表达CD32、CD64， 不表达CD16。CD32 和CD64可介导树突状细胞吞噬调理化的牛红细胞。人郎格罕细胞表达CD32 、CD64、高亲和力和低亲和力IgE受体。树突状细胞表面表
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