【求助】平端连接总无法成功鉴定（含详细实验过程，附图）

各位哥哥姐姐，我这段时间做平端连接很郁闷。以前从来没有接触过平端连接，遇到内切酶位点不一样我主要选择了PCR的方法，但这次问题比较棘手，因为插入的片段没有很明确的序列，只知道两端的酶切位点，在不选择接头的情况下，我选择了平端连接，毕竟也是练技术。
我要做的是要将pCAG质粒中的CAG启动子替换成2.3启动子。折腾了将近一周的时间仍然没有满意的鉴定结果。
我的详细路线如下：
pCAG质粒采用SalI和EcoRI双酶切，取骨架大概6000bp，2.3-GFP用SalI和NcoI双酶切，取4000bp的条带。（2.3序列基本是凭我们的经验加上测序结果找到的，是Rat ColIa1的启动子序列大概2.3+1.6kbp）限制性内切酶为Fermentas的非过期产品，电泳在1×TAE电泳缓冲液70V电压下电泳40分钟分离，切胶回收用的是QIAGEN的Gel Extraction kit。
切胶的洗脱液体积为37.5uL，这样我每个样就得到35uL的洗脱产物，然后用Fermentas的Klenow Fragment补平。在35uL的洗脱产物管里直接加入1uLdNTP混合液（2mM each），4uL buffer，还有少量的Klenow（具体多少我不记得了，好象是0.2好象是0.5，说明书上写的是0.1～0.2）。混匀，37度10分钟，75度10分钟。
然后采用QIAGEN PCR purification kit纯化产物，其中pCAG的骨架纯化后再用CIP去磷酸化（NEB）37度1小时后再次纯化。
电泳估计两片段的量，然后采用NEB的T4连接酶进行连接。2.3和pCAG的摩尔比为1：3，T4 ligase我第一次用的是普通浓度的10uL连接体系里加入了1uL，后来又用了5×浓度的也是10uL体系里加入1uL。然后20度4小时甚至过夜。
连接产物没有失活直接用DH5a进行转化，电转和化转都试过。每个板子用100uL涂板子，然后37度过夜。电转的板子上too many菌落，化转的板子一个板子30来个菌落。
我在电脑上用软件将预知产物进行拼接，理论上使用pstI可以鉴定，如下图。
于是我就挑了10个菌落然后过夜小提，PstI酶切，然后10个都只有两条带。