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【求助】载体构建快一个月了!2400bp DNA 连不上pGL3-basic !

最后编辑于 2009-04-10 · IP 美国美国
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这个帖子发布于 16 年零 78 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近构建载体分析启动子,将2400bpDNA与pGL3-basic!(4818bp)相连。酶切位点是Kpn1和Mlu1。Kpn1双酶切或单酶切载体时,除了主要条带较粗外,均发现好多条更小的条带,但主要条带是最粗的。前后连接了三次。载体、插入片段均试过同管双酶切,两步单酶切结合胶回收。Amp LB板涂菌,均可长出菌落但酶切鉴定(单或双酶切)几乎都和未切的载体DNA一样,两条带,根本切不动,比较了质粒的大小,发现根本没有插入片段。
另外上游引物是和模板DNA一致的,下游引物引入了Mlu1. 连接用的是Promega的连接KIT,室温连接15-20min,连接体系为8或10ul。实验室另外一个曾用这个kit连接过大片段。
问:1、Kpn1是这么非专一性的酶吗?刚从Promega买的.
2、未插入片段就算了,酶切应该是一条带,为什么还是两条带,酶也切不动呢?
快一个月了,怎么办,请指点啊。



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