顺式作用元件查找，报告载体构建，EMSA探针设计

在转录因子或转录调控中，为了证明转录因子对某类基因进行调控，通常需要找到结合位点，以及该位点可以通过报告载体检测，以及体外EMSA结合验证。

一、ARE search

什么是ARE？

ARE是指顺式作用元件，它是反式作用因子结合到DNA上的较为保守的序列。

为什么找ARE序列?

在转录因子的研究中，研究者们发现，特定的转录因子总是趋向于结合一类特定的保守性较高的序列，将其归纳总结后，将其作为这个转录因子转录调控时特有的序列。当我们研究一个基因是否为这个转录因子的下游基因时（即这一个基因是否受这个转录因子调控），我们首先会考虑这个基因是否含有这个转录因子结合的位点（即ARE），所以我们要找这个基因是否含有这个转录因子结合的ARE。

这里我用转录因子NRF2结合到启动子区进行抗氧化调控为例子。其保守序列目前公认为：TGASnnnGC (S: G/C)

1.在NCBI、KEGG、ensembl数据库中都能操作，这里以NCBI为例输入NR1I2，在导航栏点击Homo sapiens NR1I2。

2.点击横线,进入该基因介绍页面

3.点击小红框“genebank”，进入序列信息页面，注意红箭头方向即转录方向，方向往右，起始位点在左边，反之同理

4.往下拉找CDS

通常以最小的CDS为最长的剪接体，所以选择最小的CDS，如图658，即起始密码子位置。

往上再选5000（注意这里的往上指从上图ORIGIN碱基1开始，往转录相反的方向 ）或者10000，拉到上面看右边，将红框位置减5000表示往上选5000

修改后，点update view

这时候数据默认从你设定的值开始，所以CDS状态变为5658

5.ORIGIN从1到5658就是上游5658bp，即-5658 — +1（ATG）

6.Snapgene上ARE查找：

1）将序列复制到snapgene上

2）进入这个页面后选择sequence，CTRL+F调出搜索框

3）输入搜索序列，如TGACNNNGC（N代表可变碱基）,NEXT

4）就可以得到你要查的ARE序列所处的位置了。

二、报告载体构建

(不带启动子)将找到的ARE作为片段中心，选择30-150bp长度的片段，用合成或者PCR的方法进行扩增，然后连上载体pGL4.27,进行双荧光素酶检测。

（带启动子）将找到的ARE与启动子一起扩增（1000-3000bp），PCR扩增后连接到pGL4.72上，进行荧光素酶检测。这部分比较省略，不懂的同学可以问。

三、EMSA

为了检测转录因子体外与DNA结合情况，通常进行EMSA实验

EMSA: 电动迁移率检测，研究核酸与蛋白结合情况分析实验。可以进行DNA与蛋白，RNA与蛋白定性、定量结合分析。在EMSA中观察到移位带后，需要对移位带进行进一步加抗体等研究，叫超级移位（supershift）或竞争性EMSA。

EMSA实验操作（对于有激光扫描仪的实验室）：

1.探针及竞争探针准备

短探针直接在寡聚DNA片段合成时加5FAM或6FAM，加法如图，注意为了荧光强度，可以在互补的两段oligo均加上FAM标记。互补寡聚DNA片段，标记加在5'或者3’都可以。

然后通过退火得到双链。退火缓冲液配置【2x Annealing Buffer 20 mM Tris-HCl（PH 8.0），2mM EDTA，0.5% Tween 20，100 mM KCl 这是我在用的配方】附上Sigma公司的Annealing Buffer配方：10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA

体系：

PCR程序：

红色部分为退火程序，如果PCR仪器允许精细降温，每8s下降0.1℃。那么就设置循环（这里的数学问题是每8s下降0.1为一个循环，从90降至25，需要几个循环），

(90-25)/0.1=700, 循环程序设定ΔT=-0.1℃，time 8s,700 cycles

不具备精细控温PCR仪器的，可以设置为每90s下降1℃,即循环设置为ΔT=-1℃，time 90s,70cycles

这里不懂如何退火可以直接购买试剂盒。

！对于长片段，70nt以上的，可以先设计引物，在两端引物的5'端添加FAM标签。用普通PCR的方法将带标签的双链探针直接扩增出来。

竞争探针: 就是相同的寡聚DNA片段，只是在引物合成时不加FAM标记。

纯化：做完退火之后，用DNA纯化试剂盒纯化，最好选用允许小片段DNA纯化试剂盒，之后可以加100-200ul的水进行洗脱。这一步很必要，因为不纯化退火使用的缓冲液和酶体系会影响后续实验。（我在实验室经常讲：上一步用了酶试剂,下一步还将涉及酶促反应，两部之间应增加DNA纯化步骤）

2.非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制

(1)  安装垂直电泳玻璃板，并进行渗漏检查；

(2)  配制总体积为10 mL的3.6%非变性聚丙烯酰胺凝胶（胶的浓度3%-5%，蛋白越大胶的浓度越低，聚合形式越复杂，蛋白浓度越低），体系如下：

(3)  TEMED应该后加，配好之后轻轻地摇晃混匀，用1 mL移液器快速将溶液灌入制胶玻璃板内，立即插入样孔梳子；

(4)  待凝胶完全凝结后，小心移出梳子，将凝胶玻璃板固定到电泳装置上，放到胶槽里，往胶槽里倒入0.5×TBE电泳缓冲液（10xTBE母液：Tris 900mM，Boric acid 900mM，EDTA 20mM），没过电泳底部的导线。上样前应当提前将胶电泳10-30min。

3.样品准备

(1)  准备8个小薄壁管（我通常使用8连管），编号1-8，每管加入5 μLDNA Binding Buffer；

(2)   除了1号对照管，其余加入不同稀释浓度的蛋白液，从稀到浓，用重蒸水补足9ul，混匀后放置10 min。对于每个蛋白和每种探针来讲，先进行蛋白浓度梯度实验及探针量摸索。目的是先进行结合条件摸索以及精度和最佳蛋白浓度检测。

(3)  往所有管中再加入1 μL 带有荧光标签的DNA片段，混匀室温后避光放置20 min；

(4)  每管加入1 μL DNA Loading dye（10x无色上样缓冲液：50%甘油，1mM EDTA）混匀，上样；（用FAM标签也可以用带有溴酚蓝的有色缓冲液上样）

(5)  在80V电泳60 min（电压与时间设定与DNA片段大小有关，跑到3/4位置时，30bp, 80V 50min, 50bp, 80V 60min, 100bp,90V 80min），取出凝胶玻璃板，清洗吸干表面的水分。

对于已经摸索好蛋白浓度,进行后续文章内容实验时建议的分组是：

A:探针 B:探针+蛋白 C:探针+蛋白+冷探针 D：探针+蛋白+关键位点突变冷探针 E：探针+蛋白+抗体（对于纯化蛋白可以去掉）**

4.扫描成像

(1)  将凝胶玻璃板放置到Bio-Red激光扫描仪成像；

(2)  开启软件进行扫描，调节标签敏感度，得到图片。

**超级位移EMSA（选择性阅读）

上面E组即超级位移EMSA

1.什么是“超级位移EMSA”？

在蛋白质和核酸相互作用后，添加抗体，以检查抗体是否能与蛋白质-DNA或蛋白质-RNA复合物结合，从而产生更大的复合物，并产生更大的位移。这种方法称为超移位EMSA，移位较大的频带称为超移位频带。

2.超移位EMSA原理

超移位EMSA的原理很容易理解。抗体与DNA-蛋白质或RNA-蛋白质复合物中的蛋白质（抗原）结合会大大增加其大小，并导致复合物在凝胶中的移动缓慢或停止。

虽然特定蛋白质与靶核酸结合会导致特征性移位，但相对迁移率的变化并不能识别移位复合物中的结合蛋白质是否为目的蛋白。与探针结合的蛋白质的鉴定，通常是通过在结合反应中加入对DNA序列有结合效应的假定蛋白（目的蛋白）的特异性的抗体来完成的。如果感兴趣的蛋白质与目标DNA结合，抗体将与该蛋白质-DNA复合物结合，进一步降低其相对于未结合DNA的流动性，称之为“超移位”。

3.什么时候需要做超移位EMSA？

常规EMSA后，在这些方面可能需要超移位EMSA：

（1）确定蛋白质/核酸相互作用的特异性

（2）确定蛋白质/核酸复合物中转录因子家族的激活亚单位。许多转录因子有许多亚单位与不同细胞系或问题中的同一结构域结合。例如，人类NFkB有几个亚单位；p65、p52、p50、c-rel和v-rel。所有这些亚单位都能够绑定到kB域。由于传统的EMSA不能识别蛋白质/核酸复合物中的亚单位，因此超移位EMSA是鉴定EMSA中蛋白质/DNA复合物成分的独特方法。

4.什么样的抗体可以用于超级移位EMSA？

并非所有针对特定转录因子的抗体都可用于超移位EMSA。与Super Shift EMSA一起使用的抗体应符合以下标准：

1）识别的结构域抗体应位于蛋白质-核酸复合物的表面，

2）蛋白质-核酸复合物上的结构域不应与蛋白质-核酸复合物的相互作用区域重叠

3）用于蛋白质印迹的抗体不能与超移位EMSA一起使用，因为抗体只能识别蛋白质的变性prim结构。

4） 通过注射肽制备的抗体很少可用于超移位EMSA。

5.如何进行超移位EMSA？

为了得到超移位EMSA的预期结果，实验应考虑以下几点：

（1） 细胞或组织提取物应具有激活的蛋白质/因子，能够与DNA或RNA探针结合。

（2） 在传统的EMSA中必须检测到蛋白质-核酸复合物的移位带。

（3） 确保抗体能够与蛋白质/核酸复合物中的天然蛋白质结合。

（4） 确保抗体可用于超移位EMSA。

（3） 蛋白质和DNA/RNA反应后，应向反应混合物中添加抗体。

（4） 反应体系中不应有氧化剂。

（5） 用于EMSA的核蛋白用高盐缓冲液分离。较高体积的核提取物可能会阻止抗体与蛋白质/核酸复合物的结合。

（6） 通常，用于超移位EMSA的抗体浓度远远高于其他免疫分析方法，如Western印迹法或ELISA等。

对于没有激光扫描仪的实验室，那就不能用这种透过性激光发光的标签，可以通过偶联上生物素链霉素等，并且通过转膜，HRP孵育，最后通过化学发光检测，原理几乎一致，但实验过程相差甚远！还没空整理，要交流的同学可以私信我！