重组人组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)的质量控制

重组人组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)的质量控制

　　
　　生产rt-PA的CHO细胞的遗传稳定性不能象原核细胞那样靠分析质粒顺序就可确定，因为编码rt-PA的基因是嵌入细胞的染色体中而不容易回收。如果根据它表达的产品的肽图与标准品的肽图比较，就可判断产品是否发生突变，这种方法的敏感度可达到产品中有一个氨基酸发生变化都能检测到。这样通过分析产品就可确定细胞遗传是否稳定。
　　在生产rt-PA中设计细胞培养条件时应考虑糖基化的一致性。糖基化的程度可能影响产品在体内的半衰期和它的效价。象rt-PA这样的细胞培养产品糖基化水平的一致性，在确定了生产培养条件后是能够检测的。通常可用等电聚焦和其他化学方法分析唾液酸和中性糖，进一步可用肼解除去糖基，再用离子色谱而形成的一种有特征的指纹模式分析糖基。
　　用来生产rt-PA的CHO细胞需要复杂的生长条件，培养基中的不同成分影响着细胞生长和rt-PA的生产。培养基成分中平衡的轻度变化可以导致细胞活力和/或rt-PA产率及质量一致性发生变化。每批基础培养基和其成分的质量控制靠严格的标准，在测试生产rt-PA产品的基础培养基及它的成分时，测试系统按与生产过程相似的比例缩小，在每套系统中，CHO细胞培养在两套合适的基础培养基中同时生长，一套作为标准物质，另一套作为测试培养物，其成分在检测中是变化的。例如，测试一批血清，将其替代标准血清后，而在完全培养基中其它成分不变，在这种测试条件下标准物和测试物都要求在同一时间内准备，在过了一个合适的时间后，同时监测生长细胞的行为，然后靠定量分析产品的生产来检测测试物。
　　在生产rt-PA的CHO细胞培养物中，象噬菌体、支原体、病毒、细菌、酵母和霉菌这样的非宿主生物不能存在于培养物中。必须发展一种有效可靠的检测方法以确保培养物未被污染。

2　纯化过程及终产品的质量控制
　　因rt-PA临床使用剂量大，其终产品纯度要求超过99%。其纯化靠蛋白质的分离技术例如分子筛，离子交换，亲和层析的多种方法进行合理组合，产品纯度才能够达到要求。由于rt-PA等电点在中性左右，其结构的K2区与赖氨酸及其类似物有结合特性。故其纯化过程第一步可用阳离子交换色谱，主要起浓缩和部分纯化作用；第二步用琼脂糖偶联的赖氨酸亲和色谱，赖氨酸及其类似物配基与rt-PA特异结合可以达到很好的纯化效果，它与特异性抗体相比，使产品中不可能含有异源性的蛋白抗体，易于通过质量控制。一般细胞培养的基因工程产品中其潜在杂质及测定方法列于表2。

　　在rt-PA的纯化过程中，纯化中所用水，试剂，容器及操作步骤都应严格控制，以保证所获得产品是安全有效的，应无污染和每批产品都要一致。要用大量的测试来监视蛋白的纯化：要及时地进行内毒素测定，染菌量及效价或活性的测定。如果应用自动分析方法，包括用机器测内毒素分析，微量离心分析器测效价将会达到快速高效的效果。此外，由于rt-PA属丝氨酸蛋白酶类，常温下在Arg275与Ile276之间易水解成两条肽链，纯化后所得产品应及时放-20℃冻存。
　　rt-PA经纯化后，这时质量控制的要点是对其纯度进行分析。这阶段典型测定包括测定宿主细胞残留蛋白和内毒素以及保证产品在纯化过程中无变化的敏感测定方法，包括：SDS—PAGE，等电点聚焦，Edman末端序列分析，氨基酸组成分析，肽图，HPLC纯度分析，宿主蛋白酶联免疫测试和LAL测内毒素证实产品的一致；在这个阶段还要进行总蛋白含量和效价的测定，以确保生产一个合乎规定的批量产品；同时还须用核酸杂交检测产品中细胞残余DNA是否超过规定。
　　rt-PA经无菌过程分装和冷冻干燥后，将产生各种大小不同的剂量包装，这步主要关心由最终加工操作带来的影响，要求对产品进行热源，无菌，效价，蛋白含量，一致性，赋型剂化学含量的检测，此外冷冻干燥产品还要进行湿度分析。
　　常规生物制品的稳定性靠估计产品的效价或在动物生物测试中的活性，基因工程产品还必须对产品一致性，纯度，分子特征等多方面加以证实。蛋白质可存在多种变化方式，包括：蛋白酶水解，聚合作用，变性作用，脱酰胺作用，氧化作用，磷酸化作用和赋型剂化学还原。在rt-PA中，为了证实产品的稳定性，许多分析方法，例如：SDS—PAGE，Western印迹，等电点聚焦，肽图分析，高分辨率HPLC，N末端序列分析，体外纤维蛋白溶解测效价，可用来测试rt-PA是否稳定。
3　测定rt-PA一致性，遗传稳定性，纯度和效价的某些细节
3.1　一致性和遗传稳定性
　　在细胞培养的某些阶段轻微变化可能导致分子发生突变，然而在细胞培养阶段，严格控制从原始细胞库来的世代细胞的生长分裂，即使有较高频率的突变，都不可能积累。此外培养基的组成成分，血清及添加剂的来源与质量都应给与特别控制，这才能保证每批产品一致。
　　用来评估rt-PA分子的一级结构的一致性和真实性最有力的方法是肽图，这种方法长期与Edman降解测氨基酸顺序结合，rt-PA中的二硫键被还原和碘乙酸处理羧甲基化，接着用胰蛋白酶降解，rt-PA有51个胰蛋白酶切位点，再用反相HPLC分离裂解片断，可获得一个洗脱峰图谱，蛋白质不同一级结构就不一致，肽图也就不一样。
　　rt-PA的肽图有很高的重复性和一致性，虽然不同时间不同仪器，同一水解片断的洗脱峰的出现时间先后可能会发生变化，但在同一次测试中标准品和测试品的分析是有很高重复性的，对于有突变的蛋白质，它的洗脱峰与标准品的洗脱峰图谱不一致，这就能产生一个很好的区别。蛋白分子由于糖基化不均一要产生不同的峰簇，经过进一步分析可确定一级顺序是否正确和每批产品糖链是否一致。据估计样品中5%的分子的单个残基被替换都能发现，例如rt-PA分子在275处谷氨酸替换了精氨酸残基，其肽图就与标准不一致，有一个洗脱峰明显的不同于标准的洗脱峰。
3.2　纯度
3.2.1　免疫法测定宿主细胞残留蛋白　重组DNA来源的生物制品应用放射免疫(RIA)和ELISA方法可以测定来自宿主细胞的ppm浓度的蛋白杂质，这些蛋白杂质包括了许多种潜在的杂蛋白。因此要求对RIA和ELASA方法的灵敏度和特异性的要求较高，以尽可能地测定到这些杂蛋白。一般的多抗原ELISA方法是不可能有较好的效果，这是因为产品被包被时，酶联板上许多位点被rt-PA占据，而宿主细胞蛋白占据很少位点，这就导致当产品有很高的纯度时检测信号偏低。而夹心ELISA就可避免这种情况发生，先将亲和纯化的宿主细胞蛋白抗体包被在酶联板上，再加入rt-PA样品，这样rt-PA样品中的宿主细胞蛋白就可能大量连接上去，加入酶联抗体温育，显色，即可测出宿主蛋白的量。其敏感度可达到每毫升毫克水平rt-PA时能检测到纳克宿主细胞蛋白。
　　这种夹心ELISA首先要求制备不含产品或目标蛋白的宿主细胞蛋白；接着用它作为后来制备多克隆抗体的免疫抗原和协助多克隆抗体的亲和纯化；最后辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶按比例偶联到纯化的多克隆抗体上，作为夹心ELISA的第二层抗体。
3.2.2　非免疫测定检测产品纯度　用银染的SDS-PAGE是常用的测定多肽纯度的方法，但这种方法不能发现性质类似于产品的杂质，因SDS-PAGE分离多肽靠分子量大小，而银染的敏感度在25—50ppm。rt-PA是几种形式的混合物，还原和非还原SDS-PAGE能提供这几种形式的比例是否一致及其是否有杂质的信息。
　　SDS—PAGE还能提供Ⅰ型rt-PA和Ⅱ型rt-PA在每批产品中比例是否一致的信息；此外rt-PA还存在相同活性的一条链和两条链形式，因为它在275和276残基间易断裂，精确测定从一条断裂成两条链的比例在有SDS和还原剂时可用HPLC方法，这种方法不但可以产生一个两种链的精确比例，也可用在生产中每批产品是否一致的标志。
3.2.3　残余细胞DNA　按照WHO规定每个剂量生物制品残余DNA含量应小于100pg,rt-PA治疗心肌梗塞每个剂量允许用100mg,与其它生物制品比较，其用量大，细胞残余DNA的控制就特别重要。
　　一些经典的核酸检测方法及较灵敏的荧光方法较难达到这一要求，而地高辛标记的核酸探针是目前非放射性标记探针中较理想的一种。经验证该探针特异性好，因地高辛仅存在于洋地黄类植物中，其它生物体内无内源性洋地黄；此外，抗地高辛抗体与其它类固醇无杂交反应。该探针灵敏度高，可检测出0.1pgDNA，并能避免生物素标记探针检测时由DNA物质引起的假阳性。
　　最敏感的测量DNA的方法是根据dot杂交方法。为了确保发现产品中所有潜在DNA，用从rt-PA的CHO细胞中分离得到的DNA作为探针模板，可与产品中的任何DNA结合，从而检测出其中的微量DNA。
3.3　效价
　　生物制品的效价一般用生物活性的测定方法确定，要求在一个控制的环境中进行，关键是要选择一个标准品。WHO和NIBSC已经建立了rt-PA的标准品及推荐使用效价的测试方法。
　　rt-PA的效价可用形成色素的微量滴定板测定法和体外血凝块分解测定法。这两种测试方法在敏感性、重复性及有效性的比较上，前者在剂量反应曲线上不平行，而后者却观察到是平行的。因此，色素测定法受到限制。而单批rt-PA的效价用机器血凝分解法测定以rt-PA的活性国际单位估算。其效价值与生产厂商的测定值非常一致。

4　　基因工程药物的质控在医药产品发展中有特殊地位，这些技术常用作确保复杂的生物大分子产品的质量。联合使用先进的免疫分析方法，分子生物学方法和现代分析化学的方法和传统质控是必要的，这些控制系统在复杂的控制中是必要的和重要的，也希望发展新技术来增加象rt-PA这样的生物药物产品的控制。