【进展】端粒和端粒酶的研究进展

1 端粒和端粒酶的研究进展
由于在绝大多数恶性肿瘤（约90%以上）中都可以检测到端粒酶的特异性表达及较高的端粒酶活性，研究发现其与肿瘤发生、基因表达调控、衰老、细胞永生化等有着密切的关系。所以近几年来有关端粒及端粒酶活性与癌的关系的研究成了国内外的研究热点。端粒酶的功能主要在于合成染色体端粒的重复序列，以维持端粒长度的稳定性。端粒酶也能对断裂染色体原位形成端粒。端粒酶在正常细胞中是否还发挥其他功能，目前还不清楚。端粒酶是一种核酸蛋白复合物，其组分包括RNA、蛋白亚基。本研究中将对细胞周期抑制因子的过表达对端粒酶活性的影响作初步的探讨，所以现将端粒和端粒酶及其活性调节的研究背景和进展作如下综述。
1.1 端粒
在30年代末MeClintock和Muller发现天然染色体末端与断裂的DNA不同，它有可防止染色体末端发生端-端融合的结构。近年深入研究发现染色体的这种线性末端具有高度的保守结构，都是由随机的DNA重复序列与相关蛋白组成。
在人和其它脊椎动物中，端粒是典型的(TTAGGG)n串联并富含G的重复序列，这些序列在进化中高度保守。端粒在植物、微生物、动物的染色体中广泛存在，端粒DNA很相似，主要由非常短而且数目精确的串联重复DNA排列而成，在3’端富含鸟嘌呤，长度大约为12-16个核苷酸。个别种类的端粒DNA重复单元很长。端粒的DNA序列多种多样，其功能不需要独特的序列来维持。尽管在许多物种中端粒DNA有相当大的变化，但仍可在进化关系非常远的生物中发现相同的端粒序列，如所有的脊椎动物、原生动物锥虫及几种粘菌和真菌都有相同的端粒序列T2AG3 。其它情况下，尽管不同的有机体有不同的端粒序列，但彼此总有明显的相关性。端粒DNA的平均长度因物种而异。在人中大约15kb，在大鼠中可长达150kb，在小鼠中一般在5～80kb之间变化，而在尖毛虫中却只有20bp。在所有的有机体中，端粒DNA的长度总是波动变化的。酵母的端粒DNA在200到400bp间随遗传或营养状态的改变而改变。四膜虫和锥虫等有机体的端粒长度在对数期会持续增加。相反，在人体中，随着细胞的持续分裂，端粒会缓慢缩短。这些位于染色体末端富含G的端粒DNA凸出互补链12～16个核苷酸，形成一条单链并可通过非Watson Crick碱基配对G-G的连接，形成一种分子内折叠结构，以增加其稳定性，不同物种的染色体端粒DNA的长度不同，数量有几千个拷贝。
表2-1 部分端粒序列基本单位
Table 2-1 Part of Telomeric Repeat DNA Sequence
5’→3’  生 物 名 称
TTAGGG  哺乳动物：人类（Homo Sapiens）
  脊椎动物：鼠（Mus spp.）
  粘菌类： 绒泡菌属(Physarum)
  鞭毛原生动物：锥虫属(Trypanosoma)
  真菌类：脉孢菌（Neurospora）
TTGGGG  纤毛虫：四膜虫(Tetrahymena)
   瞬目虫属(Giaucoma)
TT（T/G）GGGG  全毛亚纲纤毛虫：草履虫(Paramecium)
TT(T/C)AGGG  孢子虫：疟原虫（Plasmodium）
TTTTGGGG  纤毛虫：尖毛虫(Oxytricha)
  游仆虫(Euplotes)
TTTAGGG  高等植物:拟南芥属(Arabidopsis)
TTTTAGGG  藻类：衣滴虫(Chiamydomonas)
CATTG2-5（A）  分生酵母： 粟酒裂殖酵母(Saecharomyces pombe)
T（G）2-3（TG）1-6  芽生酵母：酿酒酵母(Saecharomyces cerevisiae)
端粒分为两个结构功能区，一个为端粒重复双螺旋DNA，另一个是端粒末端序列。通过用化学方法直接测定四膜虫的端粒序列，证实四膜虫具有六聚体重复序列(CCCCAA/TTGGGG)并具有极性。含有TTGGGG重复序列的G链（互补链为C链）由Watson-Crick端粒双股螺旋末端向外延伸形成含两个重复单位的3’端悬突，这一特征具有种系发育的保守性，在体内对于端粒酶识别很重要。除了双链DNA和悬突区域外，直接与端粒重复序列相连的序列构成了第三个结构区域，可能与端粒的功能有关，称为端粒相关序列（telomere-associated sequence ,TAS）,这些序列在种内和种间有很大差异。
端粒参与许多重要的生物功能，它可以防止染色体的重组、末端的相互融合、作为DNA损伤识别部位、保证染色体的完整复制、作为细胞核内染色体的功能组成部分、参与基因表达的调节、作为“分子时钟”控制人细胞的增殖能力及细胞进入衰老。
1.2 端粒酶
1984年首次从四膜虫(T hyperan-gularus)细胞提取物中发现了端粒酶，1989年发现了人端粒酶，1995年成功克隆了人端粒酶RNA(hTR)。端粒酶是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白酶，是一种自身携带RNA模板的逆转录酶，为RNA依赖的DNA聚合酶，能够在缺少DNA模板的情况下合成端粒寡核苷酸片段，维持端粒的长度，解决“末端复制问题”，其活性取决于端粒酶的RNA和蛋白质亚基。研究表明，缺失端粒酶RNA基因会导致端粒缩短和细胞死亡，这表明模板RNA的重要性。
端粒酶的RNA亚基是合成端粒DNA的模板，实验证明它对端粒酶的结构和催化活性都十分重要[39-41]。现在已从纤毛虫、酿酒酵母、真菌、小鼠和人的Hela细胞中克隆出了30多个端粒酶RNA基因。这些基因编码的RNA在一级结构上差异很大。如纤毛虫的端粒酶RNA的大小从148到209个核苷酸变化，具有保守的二级结构；脊椎动物的端粒酶RNA则更长，约从382到559核苷酸不等[42-43]；酵母的长度为1200–1300核苷酸，都包含有合成端粒重复序列的模板序列，在大多数的端粒酶RNA中，模板序列都多位于5’端约50nt处，而酵母位于约450nt处，这些基因编码的RNA在一级结构上差异很大，不仅在进化过程中亲缘关系较远的生物之间无保守性，而且在较近的生物之间也有差异。如在嗜热四膜虫和四膜虫的端粒酶RNA基因之间仅有72%相同，但二级结构上很保守，人和小鼠之间仅有65%同源性，然而其表达产物端粒重复序列却相同。在模板区域小鼠RNA为8个核苷酸组成，而人由11个核苷酸组成，二级结构保守。推测只有在三级结构上才能找到与端粒酶功能有关的共同结构特征。
端粒酶RNA主要功能是端粒合成的模板，改变模板的任一序列都会改变合成的端粒序列，这在纤毛虫，酵母，小鼠，人上都得到证实。有些突变不影响端粒酶活性，但有一些可导致端粒缩短，细胞衰老和凋亡，这都表明模板RNA对端粒酶的活性至关重要。
研究发现，端粒酶在大多数正常体细胞组织中呈阴性而在肿瘤组织中呈阳性，因此普遍认为端粒酶在肿瘤的发生发展过程中具有重要意义。虽然对端粒酶RNA组分结构的研究先于蛋白质组分，但RNA的水平在多种肿瘤中与端粒酶的活性并无相关性，提示存在其它因素调节端粒酶的活性。端粒酶的催化亚基已经在酵母、原生动物和人中分离出来。该蛋白质亚基的功能区与已知的反转录酶(reverse transcriptase, RTase)在序列和功能上有明显的相似性，故称为端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)。TERT最先在游扑虫中鉴定出来，随后在人、鼠、酵母等有机体中分别鉴定和克隆。从游扑虫到人类端粒酶催化亚基的结构都非常相似，它们都含有端粒酶特有的基元T和7个保守的反转录基元。这说明端粒酶是一种非常古老的结构。
2 端粒酶活性的调控
随着对端粒酶结构的认识，对端粒酶功能的研究亦逐步深入，高灵敏TRAP法的应用，使我们能对各种人的正常细胞和肿瘤中端粒酶的活性进行定量和定性地理解。在正常人的大多数体细胞中都没有端粒酶活性，在胚胎发育过程中端粒酶的活性受到严格的调控，只在某些组织如雌性的卵细胞、激活的淋巴细胞及各种干细胞群及有高增殖潜力的正常细胞中都有高端粒酶活性以保持端粒长度和染色体的稳定。
端粒酶的活性调节可发生在各水平上，包括转录、mRNA的剪接与成熟和hTR与hTERT的修饰、各组分的转运与亚细胞定位、活性端粒酶核糖核蛋白的组装、端粒酶核糖核蛋白在端粒上的准入和功能的发挥。除了生长相关的调节之外，端粒酶的活性还受到分化、细胞内外的信号如紫外线辐射、IFN-α和雌激素的调节。
在端粒酶的核心组分中催化亚单位(hTERT)是端粒酶活性的限定性因素。hTERT与端粒酶的活性和癌症的发生发展过程密切相关，它在正常的细胞中受到抑制而在永生化过程中其转录被重新激活或上调。端粒酶活化被认为是细胞永生化和癌症发生的关键步骤。通过比较TR和TERT表达水平与端粒酶活性的研究以及外源TERT基因的表达, 表明端粒酶催化亚基表达是人端粒酶活性的限制因素[44-45]。哺乳动物细胞中端粒酶活性的调控是多因素的, 转录调控是主要的调控机制。hTERT基因及其启动子序列的克隆和鉴定对端粒酶调控机制提供了有力的工具。通过序列分析，hTERT启动子-报告基因复合物的瞬时转染，电泳泳动率迁移分析和DNA酶足迹分析，已鉴定了hTERT的5’-侧翼区域[46-49]。核心启动子包括从转录起始位点上游283nt到第一个外显子的78nt处的序列，富含GC序列，缺少TATA和CAATbox，还包括许多潜在的转录因子结合元件。序列分析鉴定了两个潜在的转录因子结合元件，两个E-box，具有核心回文序列CACGTG, 位于177nt (末端E-box)和32nt(近端E-box)。为c-Myc结合元件，c-Myc在细胞增殖和转化中起重要作用[50-51]。 在不同细胞型中瞬时转染不同的hTERT启动子－报告基因复合物显示启动子活性与内源的hTERT基因表达和端粒酶活性之间的相关性。这些发现进一步支持了hTERT基因转录调控是端粒酶活性限速步骤的观点。
Kyo等[52]确定了启动子上181bp的序列与hTERT基因表达有关。利用携带hTERT启动子的报告基因进行瞬时表达，鉴定转录调控因子。突变分析显示在核心启动子5’区含有E-box(CACGTG)，可结合Myc/Max，而3’区含有GC-box,可结合Sp1，都是反式作用所必需。在E-box 或GC-box产生突变明显降低启动子的转录活性。过量表达Myc/Max或Sp1导致转录活化，而表达Mad/Max则起抑制作用。但当Sp1结合位点突变时，Myc/Max的激活作用不明显。c-Myc和Sp1的表达与hTERT的转录活性之间呈正相关。通过对成纤维细胞转化的不同时期观察，发现当细胞克服复制性衰老获得永生化性质后，c-Myc和 Sp1表达活性升高。表明c-Myc和Sp1协同作用，是决定hTERT表达的重要因素，而Myc/Max与Mad/Max之间的转化可能在端粒酶调控上起重要作用。
Tzukerman等[52]应用不同的细胞分化模型体系 (人胚胎干细胞、鼠F9细胞,和人HL-60前髓细胞)转染三种不同长度启动子－报告基因复合物，确定细胞分化后端粒酶活性降低和hTERT基因启动子调控之间的关系。发现三个模型体系处于非分化状态时，所有启动子-报告基因复合物都产生了高水平的报告活性。其中最小的核心启动子(ATG上游283nt)转录活性最高。凝胶泳动率分析表明转录因子结合在核心启动子的两个E-box。诱导分化后，启动子活性与转录因子结合活性随时间不断降低。Tzukerman还在核心启动子序列中发现了一个新元件MT-box (CGTGGGAAG)，与近端E-box有部分重合。MT-box点突变也显示转录因子结合与启动子活性之间的相关性。表明细胞分化对端粒酶活性的影响很大程度上由TERT启动子活化水平决定。
Misiti等[53]发现雌激素及其受体参与hTERT的转录调控。通过对hTERT5’侧翼序列序列分析，发现存在潜在的雌激素响应元件(ERE)，可在体外结合人雌激素受体(ER)。DNA足迹分析显示，用17-雌二酮(E2)处理后，ER阳性细胞的ERE发生了专一性的修饰，产生依赖雌激素的染色体结构改变，而ER阴性细胞未发生变化。在E2作用下，ER的瞬时表达导致hTERT的启动子活性显著增强，当ER突变后，这种作用减弱。
Xu等[54]发现组蛋白去乙酰化在人细胞中参与hTERT基因表达抑制。在端粒酶阴性的细胞中用制滴菌素A抑制组蛋白去乙酰化酶，导致端粒酶活性的活化和hTERT mRNA的正调控。在hTERT启动子控制下的报告基因瞬时转染实验表明这个启动子可被制滴菌素A活化。Mad蛋白对hTERT启动子的抑制需要组蛋白去乙酰化酶活性，而制滴菌素A导致的去抑制不依赖于位于核心区的E-box。
Fujimoto等[55]利用瞬时表达分析，鉴定了hTERT启动子上400bp的沉默子，处于核心启动子上游-776和-378处。沉默子的抑制效果可被细胞分化加强。通过序列分析发现在这个区域有多个骨髓专一性锌指蛋白2(MZF-2)的结合位点，这些位点突变导致hTERT转录活化。MZF-2过表达导致hTERT转录抑制和端粒酶活性降低。表明hTERT核心启动子上游400bp区域是负调控区，而且MZF-2可能是负调控因子。
鼠mTERT启动子的转染实验表明核心启动子区域有225bp，这个区域也含有结合Sp1家族蛋白的GC-boxes 以及结合c-Myc的E-box。另外，Sp1,Sp3 和c-Myc的DNA结合活性在肌肉生成过程中表现为负调控。表明Sp1, Sp3和 c-Myc在鼠TERT活化过程中的关键作用，缺乏这些因子导致在肌肉细胞分化中mTERT基因的负调控。对鼠TERT启动子分析还发现了转录因子NF-κB结合位点，处于转录起始位点上游350bp[56]。
2.1 端粒酶的酶学特性——续合成端粒序列的能力
端粒酶合成能力特指能在DNA引物末端延长数个端粒重复序列，延长一个重复序列以内则不认为具有持续合成能力（进行性）。端粒酶合成能力取决于端粒酶来源和反应条件。大多数情况下端粒酶在体外不具持续合成能力，并且延伸能力小于1个重复序列，如来源于酿酒酵母，爪蟾和小鼠的端粒酶，但是从另一种酵母（S. castelli）中提取出的端粒酶却有一定的持续合成能力，可以合成5-8个端粒重复序列，小鼠、人、爪蟾、大鼠端粒酶合成能力却可以通过提高dGTP浓度而增强[57,58]。
端粒酶的大多数生物化学性质由纤毛虫系统获得，因为其中端粒酶相对丰富，对嗜热四膜虫的端粒合成能力研究得较为充分。其在体内无连续合成能力，但在体外则取决于反应条件。当端粒引物长于10nt时，此酶表现较高的持续合成能力，并且不依赖于引物的量，不因引物长度继续增加而增强。引物小于10nts时仅加上一个重复序列。此时可以通过提高引物浓度（5M）来增强酶的持续合成能力。这些资料提示，端粒酶至少有两个引物结合位点：一个是端粒酶RNA的模板区，另一个为“锚位点”。与锚位点结合可以防止产物解离，并且使酶呈现持续合成能力。四膜虫细胞抽提物的端粒酶可在产物脱落前在一个引物上加入数百个重复[59]，这需要引物和产物与一个同模板无关的底物锚定位点相互作用 [60，61]。当模板与短的引物如T2G4通过相互作用结合,可延伸到模板的5’末端，然后从酶和模板上脱落。而较长的引物如G4T2G4或(G4T2)3从模板上脱落后可保持结合在锚定位点。通过与锚定位点的相互作用，产物的3’末端从模板的5’末端释放后，可转位至模板的3’末端，以允许进行性的重复加入(图2-1)。Bryan等[62]对四膜虫端粒酶进行了突变研究(L813Y)，发现突变不影响端粒酶活性，但提高了对端粒DNA的结合能力，因此增高了端粒酶的持续合成能力。

Maine等[63]观察人端粒酶催化反应产生长的ladder，而中国仓鼠细胞(CHO)端粒酶只向引物末端加入1-2个重复。考察dGTP 升高对人和CHO端粒酶活性的影响，发现从1.5-50mM提高dGTP浓度，CHO端粒酶能产生1-8个重复，但仍不如人端粒酶在低dGTP 浓度产生的重复多。CHO端粒酶只当dGTP浓度500mM，而dATP浓度非常低时，才能产生与人端粒酶类似的6bp的ladder。引物竞争实验表明无论dGTP浓度高或低，人端粒酶表现出近100％的进行性，因此提高dGTP浓度只影响延伸效率。相反CHO细胞在低浓度表现低进行性，随浓度升高进行性升高。
仅由端粒酶RNA和端粒酶反转录酶亚基组成重组的四膜虫端粒酶，与天然端粒酶相比持续合成能力降低[64]。而且重组的端粒酶重复加入进行性需要更高的dGTP浓度。dGTP促进重复加入进行性，这似乎是所有端粒酶的固有性质。对所有已知的具有进行性的端粒酶，dGTP是产物从模板的5’末端转位到3’末端后加入的第一个核苷酸。依赖dGTP的重复加入进行性一个可能原因是dGTP浓度升高，促进dGTP与活性位点结合，并增强它作为第二重复的第一个核苷酸加入的可能性。但也可能dGTP与同活性位点无关的另一个位点相互作用以促进持续合成 [65]。如果dGTP的促进作用是引入转位后产物的第一个核苷酸，那么改变模板残基使这个核苷酸加入专一性改变，将取消对dGTP的依赖性。为了区分这两个模型，Hardy等[66]对四膜虫端粒酶的模板序列进行了突变，发现持续合成能力仍然保持了对dGTP相同的依赖性，尽管此时dGTP不是端粒重复中首先加入的核苷酸。而其他dNTP虽然已经突变为第一个掺入的核苷酸，但仍不如dGTP的促进能力高。利用dGTP的结构突变体，证明促进作用对dGTP的碱基和糖基的需要是专一性的。而且所有有促进作用的核苷酸也抑制或竞争DNA产物中dGTP的掺入。表明确实有锚定位点的存在。